耐热性木聚糖酶预处理麦草原料及麦草浆的比较研究

邱洋洋，童国林*

耐热性木聚糖酶预处理麦草原料及麦草浆的比较研究

邱洋洋，童国林*

（南京林业大学 江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室，江苏 南京 210037）

研究了耐热性木聚糖酶预处理麦草原料的工艺，并对酶处理麦草原料与碱法麦草浆酶处理的效果进行对比。结果表明：麦草木聚糖酶预处理适宜条件为酶用量40 IU/g、液比1∶9、pH值7.2、时间4 h、温度95℃。该木聚糖酶能够在中性及相对较高温环境下具有较好的酶学稳定性。对比麦草原料及浆料的木聚糖酶预处理效果表明：麦草原料经木聚糖酶处理后酶解液中还原糖含量为1.14%，而麦草浆酶处理后酶解液的还原糖含量为1.23%；经碱抽提后麦草原料还原糖溶解量增加了0.39%，而浆料则增加1.25%。说明木聚糖酶对麦草浆降解半纤维素作用明显优于对麦草原料的作用，且碱抽提提高了酶处理的效果。

耐热性木聚糖酶；麦草；麦草浆；预处理；还原糖

我国造纸工业发展所面临的主要问题是原料供求矛盾突出和节能减排任务艰巨。造纸工业发展“十二五”规划指出要以科学合理利用非木材资源，实施清洁生产新工艺为出发点，进而提高产业节能减排和综合利用水平，提高非木纤维制浆造纸质量，以缓解国内纤维资源供需矛盾和对进口木材纤维和废纸的依赖程度，达到优化造纸原料结构的目的[1]。国家明确提出要用生物技术改造传统产业，“十二五”期间，拨出专项资金支持在制浆造纸领域应用生物技术[2]，因此本文就耐热性木聚糖酶预处理麦草秸秆原料和麦草浆进行研究，为耐热型木聚糖酶应用于麦草秸秆等非木材纤维原料制浆提供理论支持。

木聚糖酶是常被用于进行浆料处理的半纤维素酶，是由D-木糖以β-1,4糖苷键连接而成的主链和由种类各异的糖基侧链组成的侧链构成[3]。其中以内切-1,4-β-D木聚糖酶为主，是对木聚糖降解起关键作用的木聚糖降解酶[4]。目前绝大多数商用木聚糖酶来源于霉菌，其有酶产量相对较高的优点，但同时存在发酵周期长、作用条件偏中性等缺点，在造纸、饲料和食品等工业的极端环境下应用受到一定限制[5]。经过近年来的不断研究，科研工作者发现了一些可以在耐极端条件下发挥作用的细菌木聚糖酶，具有较好的开发前景[6]。已报道的用于生产木聚糖酶的细菌以芽孢杆菌居多。Anand A等[7]研究了从印度高温堆肥中筛选出的一株嗜热脱氮芽孢杆菌所产的木聚糖酶，其作用的最适温度为70℃。郑宏臣等[8]分析了从造纸厂周边土壤中分离纯化出来的一株产碱性木聚糖酶的短小芽孢杆菌所产的木聚糖酶，其最适反应pH值可达8.0，最适反应温度为55℃；陈学敏等[9]在云南腾冲热泉中分离得到产木聚糖酶的菌株，经鉴定为地芽孢杆菌，研究发现其所产木聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为7.0和70℃；梁方方等[10]在堆放青贮饲料的土壤中分离出一株枯草芽孢杆菌X7，在对其所产出的酶进行研究后发现该酶最适pH值和温度分别为6.0和50℃。

本文选用的耐热耐碱木聚糖酶，来源于极端嗜热菌海栖热胞菌（Thermotoga maritime），通过海栖热胞菌的XynB基因克隆到热激表达载体pHsh中，得到了耐热性木聚糖酶[11]。对该木聚糖酶用于麦草预处理工艺条件进行优选，并就麦草原料及麦草浆料在相同处理条件下处理效果进行比较，从而为其后续开发应用研究提供理论基础。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 原料

麦草由甘肃某造纸厂提供，实验室条件下进行筛选，切片后水洗，风干储存平衡水分后测水分。

自制麦草浆：麦草在YYG3-10-1.25油浴蒸煮器内采用烧碱-AQ蒸煮工艺制得麦草浆，卡伯值14.7。

1.1.2 木聚糖酶

耐热性木聚糖酶（pHsh-XynB）的酶活为3 000 IU/mL，由南京师范大学生命科学院微生物实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 耐热性木聚糖酶酶活的测定方法

耐热性木聚糖酶活性的测定[12]，以0.5%桦树木聚糖作为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼与还原糖的显色反应进行比色，具体方法：在90 μL（25 mM pH 6.3）的磷酸钠缓冲液中加0.1 mL 1%桦树木聚糖，然后添加10 μL稀释的酶液于95℃下反应10 min，最后加入600 μL终止剂/显色剂PAHBAH（配方为：0.5 M NaOH 和溶于0.5 M HCl的5% PAHBAH体积比4∶1混合）终止反应。其混合物在沸水浴中加热10 min后，立即在冰水浴中冷却，使用分光光度计，在410 nm下测其吸收值。木聚糖酶1个活性单位定义为每分钟催化产生1 μmol木糖的酶量。

1.2.2 麦草及浆料的酶处理

将清洗风干后原料、25 mM柠檬酸钠缓冲液（pH值分别为5.2、5.7、6.2、6.7、7.2、7.7和8.2）、酶液在聚乙烯塑料袋中充分混合后，置于恒温水浴锅中加热，每隔20 min揉搓一次，使原料与酶液充分混合，反应到规定时间取出。用布袋将酶解液分离出来用于分析，所得原料用水洗干净，存放在塑料袋中平衡水分，测水分后用于后续的处理及检测。对照样处理条件与酶处理条件相同，但不加酶处理[13]。

1.2.3 麦草原料的碱处理

麦草在经过酶处理洗干净后置于聚乙烯塑料袋中，用氢氧化钠对麦草进行抽提处理。处理条件：液比1∶10，时间1 h，温度70℃，碱用量2%[14]。

1.2.4 处理液还原糖的测定

酶解液的还原糖采用DNS方法测定[15]。

1.2.5 处理液吸光度的测定

木质素在280 nm附近具有吸收峰。吸光度可作为一个相对量，间接反映木质素溶出情况。在酶解液中滴入几滴CCl3COOH，然后调节pH值到9.0，离心后取上层清液，稀释到一定倍数，在UV-751型分光光度计280 nm处测定吸光度。吸光度值可间接反映木质素溶出量[16]。

2 结果与讨论

2.1 耐热性木聚糖酶预处理工艺条件的选择

在对麦草进行酶预处理时，必须在其最优条件下进行处理。木聚糖酶是具有生物活性的大分子，在不同环境下，所表现出来的效果有所差异。预处理的过程中需综合考虑酶用量、液比、pH值、处理时间以及处理温度对木聚糖酶预处理麦草过程中的影响。在耐热性木聚糖酶预处理麦草原料研究中，以测定处理液中还原糖的含量、木质素含量和处理后稻草的得率来评价预处理效果。

2.1.1 木聚糖酶用量对麦草预处理的影响

酶用量对酶处理效果是个关键因素，酶用量越高，则溶出还原糖越多，木质素溶出量也越多，得率越低。如图 1 所示，随着酶用量不断的增加，溶出的还原糖含量和吸光值也逐渐增大，酶处理后麦草得率随酶用量不断增加而减小，在酶用量为60 IU/g时，得率有小幅上升，这可能与溶出的还原糖“回吸”有关[15]。在酶用量为40 IU/g时还原糖的含量升到较大值1.07%，木质素的吸光值为0.497，得率为90.35%。当酶用量为60 IU/g时还原糖含量和木质素吸光值都较大，而此时麦草得率却下降较多。综合考虑酶的生产成本，酶用量为40 IU/g时较为合适酶用量。

2.1.2 液比对木聚糖酶预处理的影响

由于酶处理液浓度影响酶反应速度，预处理液中酶的浓度则是由液比大小决定。液比越大，酶处理液浓度越小，酶的反应速度相对较慢；液比小，则酶处理液浓度大，但又不能使酶处理液与麦草充分均匀混合。因此，选择合适的液比就显得十分重要，既能保证一定的酶处理液浓度，又能使酶处理液与麦草充分均匀的混合，结果如图2所示。由图 2 可以知，随着液比逐渐增大，酶解液中还原糖含量先上升后下降，吸光值也是呈现出相同的趋势，酶处理后麦草得率变化趋势同还原糖以及吸光值变化趋势相似，液比为1∶9时得率在90%左右，还原糖含量为1.07%，吸光值为0.639。

图2 液比对木聚糖酶预处理的影响

2.1.3 pH值对木聚糖酶预处理的影响

酶的活性会受到其所处反应环境的影响，pH过高或者过低都会影响蛋白质的构象，甚至使酶不能正常发挥功能，木聚糖酶反应的pH值对麦草木聚糖酶预处理效果有很大的影响。针对本文所用木聚糖酶酶活特性，pH 值在5.2～8.2范围进行优化实验，结果如图3所示。由图3可知，随着pH值不断增大，处理液中还原糖含量和吸光值均先增加后下降，得率随着pH值增大而先减小后上升。反映出缓冲液的酸碱强度大小对酶的活性有较大的影响。当pH为7.2时，还原糖含量为1.15%，吸光值为0.711。此时吸光值较大，表明随木聚糖溶出木质素量较大。虽然此时还原糖含量不是最大，但考虑到脱木质素的能力及处理后得率，综上各个因素，pH值在7.2左右接近中性范围，较为合适。

图3 pH值对木聚糖酶预处理的影响

2.1.4 时间对木聚糖酶预处理的影响

该木聚糖酶具有较好的稳定性，在95℃下半衰期为2 h，但不同底物对酶的性质有不同影响，因此木聚糖酶预处理的时间也十分重要。由图4可以看出，随着反应时间由3 h延长至4 h还原糖含量和吸光值均随之增加，反应时间由4 h延长至6 h吸光值变化较小，此时还原糖含量变化也不大，说明酶解反应在前4 h相对较快，随着时间增加对预处理的影响越来越小。从图中可知，随着时间的推移，还原糖含量又有所增加，可能原因是原料表面木聚糖溶出而形成空隙增加，从而为原料内部木聚糖的溶出创造条件。因此酶处理的反应时间选择4 h。

图4 时间对木聚糖酶预处理的影响

2.1.5 温度对木聚糖酶预处理的影响

木聚糖酶在不同的温度条件下，其反应速率不同，温度对酶的影响主要有两方面，一方面是当温度升高时，酶的反映速率加快；另一方面，随着温度的升高，酶的稳定性逐渐降低，反应时间逐渐缩短，反应效果降低。酶促反应的最适温度是这两种过程平衡的结果。针对所选用的木聚糖酶对温度具有较高的适应能力及较宽的适应范围，选择在80～100℃范围进行优化。

图5 温度对木聚糖酶预处理的影响

由图5可知，随着温度的增大，还原糖含量和吸光值均先增大后逐渐减小。还原糖含量在90℃时达到最大值1.16%，然后不断减小，而吸光值在95℃达到最大值0.710，此时还原糖含量为1.15%。温度在高于95℃后，酶蛋白的活性开始降低，还原糖含量开始下降。因此，温度选择95℃。

综合以上对木聚糖酶预处理麦草的研究，木聚糖酶预处理麦草原料适宜工艺条件为：酶用量40 IU/g，液比：1∶9，pH值7.2，温度95℃，处理时间4 h。

2.2 耐热性木聚糖酶处理麦草原料与麦草浆效果的比较

2.2.1 麦草原料及麦草浆木聚糖酶处理效果的对比

在酶处理麦草原料过程中，由于麦草表面含有一层致密层，使得进行酶处理的过程酶与半纤维素接触相对困难，而麦草经蒸煮后，可以消除其影响，为探索酶处理麦草与麦草浆的效果差异，比较两者作用效果，以酶解液中还原糖含量和木质素含量来表示，结果如表1所示。由表1结果可知，麦草和麦草浆经过木聚糖酶处理后均有降解半纤维素和脱除木质素的作用。麦草原料在经木聚糖酶处理后酶解液中的原糖含量为1.14%，相对应麦草浆酶处理的还原糖含量为1.23%，反映出木聚糖酶对麦草浆降解半纤维素作用明显优于对麦草原料的作用，这是因为浆料的比表面积比麦草原料的比表面积大，木聚糖酶在浆料上的吸附性比原料的吸附性好，酶与木聚糖作用的可及度存在明显差异。麦草酶解液中木质素含量为0.35 g/L，而麦草浆酶解液中木质素含量为0.10 g/L，在蒸煮过程中已有大量的木质素溶出，原料中木质素含量要远远大于浆料中木质素含量。

表1 麦草和麦草浆酶处理液的分析

2.2.2 木聚糖酶处理麦草及麦草浆后碱抽提效果的对比

对经过酶处理的麦草和浆料进行碱抽提，碱抽提时用碱量为2%，通过对比有酶处理和无酶处理原料和浆料碱抽提后的效果如表2所示。

表2 麦草和麦草浆酶处理后碱抽提效果的比较

麦草的酶解液中还原糖含量由碱抽提的0.97%增加到酶处理后碱抽提的1.36%。而浆料则由0.08%增加到1.33%。麦草碱抽提后的木质素含量由0.56 g/L增加到0.70 g/L，浆料经过碱抽提的木质素含量也从0.17 g/L增加到0.25 g/L。不论麦草还是麦草浆，经过酶处理比没经过酶处理的碱抽提效果更好。

3 结论

1）通过对木聚糖酶预处理麦草的研究，木聚糖酶预处理最适条件：酶用量40 IU/g、液比1∶9、pH值7.2、时间4 h、温度95℃。且该木聚糖酶能在偏中性及高温的环境下具有较好的酶学稳定性，可适应于预处理阶段较高温环境。

2）在此处理条件下，麦草原料和麦草浆的酶处理效果显示：麦草浆中木聚糖在木聚糖酶处理下更容易溶出，具有更好的反应性能。麦草原料由于其表面结构影响反应性能相对较差。酶处理后进行适当的碱处理可以提高木质素和木聚糖的溶出效果。

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Comparison of Wheat Straw and Straw Pulp with Thermostable Xylanase Preteatments

QIU Yang-yang, TONG Guo-lin*
（Nanjing Forestry University, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Pulp and Papermaking Science, Nanjing 210037, China）

It was investigated that thermostable xylanase was used for the pretreatment if the raw material of wheat straw, and compared with treatment of wheat straw pulp. It was found that the suitable pretreatment condition of thermostable xylanase process was as following, the xylanase charge was 40 IU/g, liquor ratio was 1∶9, pH was 7.2, reaction time was 4h and temperature was 95℃ respectively. The result was shown that thermostable xylanase was very stable under neutral and high temperature conditions. Morever under the pretreatment condition, the thermostable xylanase could give good pretreatment ability as compared with wheat straw pulp, and helped to improve the effect of alkali extraction after pretreatment.

thermostable xylanase; wheat straw; wheat straw pulp; pretreatment; reducing sugar

TS74

A

1004-8405(2015)02-0027-07

2015-01-27

基金课题：江苏高校优势学科建设工程资助项目。

邱洋洋（1987～），男，硕士研究生；研究方向：制浆化学及生物制浆技术。

* 通讯作者：童国林，教授，博士生导师；研究方向：制浆化学、废纸再生、纤维素改性等。gtong@njfu.edu.cn