MMP-13在黏液性和非黏液性大肠癌组织中的表达差异

MMP-13在黏液性和非黏液性大肠癌组织中的表达差异

霍思博张凯谌通李春生刘铜军

(吉林大学中日联谊医院结直肠肛门外科，吉林长春130033)

摘要〔〕目的探讨在黏液性和非黏液性大肠癌(CRC)中基质金属蛋白酶(MMP)-13和病理学表达的临床意义。方法采用组织芯片技术及免疫组化方法检测180例CRC组织(含黏液性和非黏液性大肠癌各90例)中MMP-13的表达情况，采用χ2检验分析黏液性和非黏液性CRC患者各临床病理学特征及其与MMP-13表达的关系。结果与非黏液性大肠癌相比，黏液性大肠癌与年龄、侵袭度深、淋巴结高转移率和瘤周及瘤内的中性粒细胞浸润显著相关，但与性别、肿瘤大小、肿瘤位置及肿瘤的生长形态并无明显的相关关系。在非黏液性CRC的MMP-13阳性表达率显著高于黏液性CRC。大多数的黏液性CRC不表达或仅弱表达MMP-13，但其肿瘤侵袭深度及淋巴结转移率却显著高于非黏液性CRC。结论在对CRC的靶向治疗中，针对MMP-13的靶向治疗对非黏液性CRC比对黏液性大肠癌更有效。

关键词〔〕基质金属蛋白酶-13；黏液性大肠癌；非黏液性大肠癌；组织芯片

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

基金项目：吉林省科技厅青年基金(201101048)

通讯作者：刘铜军(1962-)，男，教授，博士生导师，主要从事可生物降解材料的临床应用及大肠癌的基础与临床研究。

第一作者：霍思博(1987-)，男，硕士,主要从事可生物降解材料的临床应用及大肠癌的基础与临床研究。

黏液性大肠癌(CRC)(包括黏液腺癌和印戒腺癌)是一类特殊的CRC组织学类型，其特征是黏液成分占肿瘤的50%以上。基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤侵袭、转移和新生血管形成过程中具有十分重要的促进作用〔1〕，而MMP-13(胶原酶3)位于MMP活化级联中的中心位置，通过激活MMP-2和MMP-9以及被MMP-2、MMP-3和MT1-MMP (膜型MMP-1)激活发挥作用〔2〕。MMP-13在多种癌症中均有表达〔3〕，最早发现于人乳腺癌组织中〔3〕。但已有的文献证明，CRC组织中表达多种MMP〔4〕，目前少有文献报道MMP-13在CRC中的表达情况，尤其是MMP-13在黏液性CRC中的表达及其对分子靶向治疗的意义。本研究拟通过免疫组化方法检测含CRC标本的组织芯片(TMA)中MMP-13在黏液和非黏液型CRC中的表达差异，探讨MMP-13对CRC诊断及治疗中的意义。

1材料与方法

1.1一般材料收集2011年8月至2013年10月我院CRC手术患者癌组织标本180例，其中包括90例黏液性CRC(含68例黏液成分占肿瘤50%以上的黏液性腺癌和22例印戒细胞癌)和90例非黏液性CRC(含56例普通腺癌和34例黏液成分<50%的腺癌)，所有组织均由经验丰富的病理科医师再次进行组织学确诊。对肿瘤的组织学特征进行评价，包括淋巴管栓塞、周围神经浸润、腺瘤顶部出现肿瘤、与血吸虫病相关、肿瘤边缘、瘤周及瘤内的中性粒细胞。所有患者术前均未进行过任何放化疗治疗。研究获得我院伦理委员会的批准。

1.2组织芯片制作组织芯片的制作方法参照改良的铅笔尖技术〔5〕。每例样本同时点取3个0.8 mm直径的有代表性的组织用于制作组织芯片。制作成的组织芯片蜡块进行组织切片，切成4 μm厚的切片，进行常规苏木精和伊红(HE)染色，其他切片贴在经硅化玻片试剂盒(APES)包被的玻片上，用于免疫组化染色。

1.3免疫组化染色组织芯片切片常规脱蜡至水后，用0.3%H2O2(甲醇配制)处理30 min以去除内源性过氧化物酶，然后将切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)修复液(pH8.0)中进行微波热修复30 min，自然冷却后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，3 min/次。滴加小鼠抗人MMP-13单克隆抗体(1∶500稀释，Abcam公司)，4℃孵育过夜。取出后，PBS洗涤3次，3 min/次。滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗(MaxVisionTM plus试剂盒，福州迈新生物技术有限公司)，室温孵育20 min后，PBS洗涤3次，3 min/次。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精负染，中性树胶封片后，光镜下观察阳性结果。

1.4免疫组化结果判定组化结果判定采用半定量方法。MMP-13阳性为细胞质内呈棕色或棕黄色着色，按胞质着色强度分为阴性(-，0分)、弱阳性(+，1分)、阳性(，2分)和强阳性(，3分)；每个组织点中的细胞阳性率同样分为4级：0为阳性细胞率<5%，1为阳性率6%~25%，2为阳性率26%~50%，4为阳性率>50%。每个组织点的最后得分为阳性强度乘以阳性率，三点的平均分为该样本的最后得分。为了便于分析，将肿瘤划分为阴性组(得分为0)、低表达组(得分<3)和高表达组(得分≥3)。

1.5统计学方法应用SPSS16.0软件进行分析，组间的临床病理学资料分析和组织学特性分析采用χ2检验。

2结果

2.1临床病理学特征比较黏液性与非黏液性大肠癌相比，年龄明显年轻、浸润程度加深和淋巴结转移较多(P=0.017、0.008、0.008)，但与性别、肿瘤大小、TNM分期、肿瘤位置和肿瘤的生长形态无明显的相关关系(P>0.05)。见表1。

2.2两组组织学特性比较黏液性CRC的癌周及瘤内中性粒细胞浸润明显少于非黏液性组(P<0.001)，但其他的组织学特性在两组间并无明显差异(P>0.05)。见表2。

2.3MMP-13在CRC组织中的表达MMP-13阳性染色主要定位于肿瘤细胞和炎症细胞的细胞浆内(见图1)。在非黏液性CRC组织中，有65.5%的标本为MMP-13高表达，而在黏液性CRC标本中仅有16.7%表现为MMP-13高表达，二组之间的差异具有统计学意义(P<0.001，见表2)。以普通腺癌作为参照组，对4个组织学亚型的MMP-13表达进行对比分析，结果显示，普通腺癌中MMP-13的表达显著高于腺癌伴黏液成分小于肿瘤的50%的腺癌(P=0.001)、黏液腺癌(P<0.001)和印戒细胞癌(P<0.001，表3)。约有82%黏液腺癌和90%的印戒细胞癌呈MMP-13阴性或低表达。非黏液癌组织的MMP-13表达并未均匀分布，呈明显的不均一性(见图1)，而在黏液性癌中，其MMP-13表达则较为均匀(见图2)。

表1　患者的临床病理学特征〔 n(%), n=90〕

表2　180例CRC标本的组织学特性〔 n(%), n=90〕

A.肿瘤细胞胞质内强阳性均匀表达(×200)；B.肿瘤细胞胞质内不均匀表达(×200)；C.肿瘤细胞胞质内中等均匀表达(×200)；D.肿瘤细胞阴性而基质内炎症细胞呈阳性(×400) 图1　MMP-13在普通腺癌中的表达

A.黏液性腺癌组织中均匀的胞质内弱表达；B.黏液性腺癌中MMP-13表达阴性；C.印戒细胞癌中等胞质内着色；D.印戒细胞癌中阴性表达 图2　MMP-13在黏液性大肠癌中的表达

组织学类型阴性低表达高表达χ2值P值普通腺癌1(1.8)11(19.6)44(78.6)--黏液成分低于肿瘤50%的腺癌8(23.5)11(32.4)15(44.1)13.2910.001黏液腺癌27(39.7)29(42.6)12(17.7)41.028<0.001印戒细胞癌10(45.5)9(40.9)3(13.6)31.714<0.001

3讨论

基底膜和细胞外基质(EMC)是肿瘤浸润和转移的重要屏障，而MMPs是ECM降解过程中最重要的酶类之一，在肿瘤的播散与转移中起重要作用。MMP-13是MMPs的一种，可激活其他亚型的MMPs，也能被多种MMPs所激活。研究表明，MMP-13表达的上调是其他MMP分子活化作用的结果，主要作用于催化ECM的破坏，包括降解Ⅰ~Ⅳ型胶原纤维、黏连蛋白、蛋白多糖等物质，在骨骼发育、关节软骨和滑膜发育以及皮肤创伤修复等生理学过程中起重要作用〔4〕。MMP-13在多种人类疾病中表达上调，因此，被认为是一种重要的治疗靶标。近年来，在人类肿瘤中，也发现有MMP-13表达上调的现象。危蕾等〔5〕的研究表明，MMP-13 mRNA在骨巨细胞瘤中显著高表达，且与其预后密切相关。基于上述原因，有理由推论，MMP-13可能是评估CRC患者的肿瘤生物学行为及其预后的一个重要临床指标。然而目前于MMP-9和MMP-2与肿瘤浸润转移和预后相关的研究较多，但关于MMP-13在CRC中作用的研究报道较少。

本研究结果与Numata等〔6〕的研究结果一致。本研究提示对于黏液性CRC转移和浸润的过程中可能有更为重要的原因，但目前尚不完全清楚，部分原因认为可能是肿瘤内部在压力下出现了分解和扩散，使得黏液性CRC细胞可以进入腹腔和淋巴系统，进而促进肿瘤扩散到局部淋巴结〔7〕。但也有人发现，合成和分泌大量黏蛋白的肿瘤细胞系具有更强的增殖、侵袭和转移倾向〔8〕。与这些研究结果一致，黏液癌细胞可能并不需要MMP-13或其他的MMP分子介导的ECM破坏，以利于肿瘤的侵袭。

据报道〔9〕，在乳腺癌和恶性黑色素瘤等恶性肿瘤中，MMP-13的表达主要定位于肿瘤细胞的胞浆内而不是基质细胞内，但在头颈部肿瘤中，MMP-13在肿瘤细胞及周围的基质细胞中均有表达〔10〕。尽管肿瘤细胞本身可以突破多种组织障碍进行转移，但MMP-13在成纤维细胞和单核细胞中的表达与转移风险升高密切相关〔11〕。本研究中，可能是由于MMP-13和其他MMP分子的上调是在需要的部位在特定的时刻合成的〔12〕，在非黏液性CRC中MMP是肿瘤细胞侵袭所必需的，因而表达为灶性，在肿瘤边缘的浸润区最强，而在中心部位较弱，该结果不仅说明腺癌具有分泌大量MMP-13的功能，而且与腺癌浸润的生物学特性相符，而在黏液性CRC转移的过程中却并不需要MMP-13参与，所以产生了这种病理表现，具体的调控机制还有待进一步研究。研究〔13〕证明，炎症在肿瘤的进展过程中起重要作用，单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞是实体瘤瘤周及瘤内白细胞浸润的主要类型。这一过程与机体对肿瘤的免疫反应有关。在肿瘤边缘区域内，MMPs主要来源于活化的基质细胞和炎性白细胞。所以本文也强调了黏液性CRC的发生、发展和侵袭过程可能并不需要这些细胞和分子参与，同时也说明机体对黏液性的反应较弱，其病理变化与腺癌有本质的区别。但近期的一项研究〔14〕表明，曼氏血吸虫相关的CRC具有独特的病理学特征，包括高比例的多中心肿瘤和黏液型。在本研究中，与血吸虫病变相关的结肠癌的比例仅为15.3%(结果未列出)，明显低于由张宏等〔15〕报道的发病频率，这可能与中国的卫生条件逐步提高有关。

综上所述，黏液性癌的侵袭可能主要取决于黏蛋白的解离，而不是MMP-13。因此，认为在CRC治疗中，针对MMP-13的靶向治疗对非黏液性CRC比黏液性CRC更为有效。这项化验将有利于靶向治疗特定对象的选择，也为CRC的治疗提供了一个新的思路。

参考文献4

1徐洪海，吴佩，茆家定，等.胃泌素高表达型大肠癌差异表达基因研究〔J〕.中华实验外科杂志,2012;29(11)：2191-4.

2VAN Nguyen S，Skarstedt M，Löfgren S，etal.Gene polymorphism of matrix metalloproteinase-12 and-13 and association with colorectal cancer in Swedish patients〔J〕.Anticancer Res,2013；33(8)：3247-50.

3Wu D，Huang P，Wang L，etal.MicroRNA-143 inhibits cell migration and invasion by targeting matrix metalloproteinase 13 in prostate cancer〔J〕.Mol Med Rep,2013；8(2)：626-30.

4Celardo I，Antonov A，Amelio I，etal.P63 transcriptionally regulates the expression of matrix metallopeptidase 13〔J〕.Oncotarget,2014;5(5):1279-89.

5危蕾，廖苏平，郭张强，等.基质金属蛋白酶-13 mRNA在骨巨细胞瘤中的表达及其意义〔J〕.中华实验外科杂志，2010;27(6)：823-4.

6Numata M，Shiozawa M，Watanabe T，etal.The clinicopathological features of colorectal mucinous adenocarcinoma and a therapeutic strategy for the disease〔J〕.World J Surg Oncol,2012；10：109.

7Yang B，Gao J，Rao Z，etal.Clinicopathological significance and prognostic value of MMP-13 expression in colorectal cancer〔J〕.Scand J Clin Lab Invest,2012；72(6)：501-5.

8Müller-Edenborn B，Roth Z′graggen B，Bartnicka K,etal.Volatile anesthetics reduce invasion of colorectal cancer cells through down-regulation of matrix metalloproteinase-9〔J〕.Anesthesiology,2012；117(2)：293-301.

9Chang HJ，Yang MJ，Yang YH，etal.MMP13 is potentially a new tumor marker for breast cancer diagnosis〔J〕.Oncol Rep,2009；22(5)：1119-27.

10Culhaci N，Metin K，Copcu E，etal.Elevated expression of MMP-13 and TIMP-1 in head and neck squamous cell carcinomas may reflect increased tumor invasiveness〔J〕.BMC Cancer,2004；4(1)：42.

11Vizoso FJ，Gonzalez LO，Corte MD，etal.Study of matrix met-alloproteinase and their inhibitors in breast cancer〔J〕.Br J Cancer,2007；96(6)：903-11.

12Yang B，Su K，Gao J，etal.Expression and prognostic value of matrix metalloproteinase-7 in colorectal cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2012；13(3)：1049-52.

13González L，Eiró N，González LO，etal.Effect of the expression of matrix metalloproteases and their tissue inhibitors on survival of patients with resectable colorectal cancer〔J〕.Dig Dis Sci,2012；57(8)：2063-71.

14Rath T，Stöckle J，Roderfeld M，etal.Matrix metalloproteinase-13 is regulated by toll-like receptor-9 in colorectal cancer cells and mediates cellular migration〔J〕.Oncol Lett,2011；2(3)：483-8.

15张宏，丛进春，崔明明，等.RECK和基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子C在结直肠癌中的表达及意义〔J〕.中华胃肠外科杂志，2010；13(9)：695-8.

〔2014-01-15修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)