胆酸对大鼠肝部分切除术后肝细胞脂质代谢及法尼醇X受体表达的影响

胆酸对大鼠肝部分切除术后肝细胞脂质代谢及法尼醇X受体表达的影响

丁隆杨宇1曲义坤何淑玲孙国娟夏伟滨徐剑

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探讨胆酸对肝细胞脂质代谢、法尼醇X受体(FXR)及肝再生的影响。方法建立部分肝切除大鼠模型，随机分成3组：G1组(正常喂养)，G2组(给予0.2%胆酸喂养)，G3组(正常饮食中加入50%葡萄糖)，每组10只，喂养后7 d切除大鼠70%肝组织，于术后72 h取出肝组织及血液标本，检测相关指标。RT-PCR和Western印迹检测SHP、CYP7A1、BSEP的表达；试剂盒检测肝细胞中甘油三酯、胆固醇的水平。结果与G1相比，G2组小异二聚体伴侣(SHP)、胆盐输出泵(BSEP)表达显著升高(P<0.05)，胆固醇7α-羟化醇(CYP7A1)表达显著降低(P<0.05)；G3组SHP、BSEP表达略增高(P<0.05)，CYP7A1显著升高(P<0.05)。G2组甘油三酯(TG)水平显著降低，胆固醇(TC)含量显著升高，而G3组TG略升高，TC含量降低(均P<0.05)。结论胆酸可促进肝细胞再生，FXR在调控肝细胞代谢中发挥重要作用。

关键词〔〕法尼醇X受体(FXR)；脂质代谢；肝再生

中图分类号〔〕R-34〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81141047)；佳木斯大学科学技术重点项目(Sjz2012-12)

通讯作者：杨宇(1975-)，男，医学硕士，副教授，主要从事人体解剖学及肝再生研究。

1佳木斯大学基础医学院局部解剖学教研室

第一作者：丁隆(1978-)，女，医学博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事肝移植免疫、肝再生研究。

Effects of bile acid on the expression of FXR and lipid metabolism on rat model of hepatectomy

DING Long, YANG Yu, QU Yi-Kun,etal.

First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154002, Heilongjiang, China

Abstract【】ObjectiveObjectives To investigate the effect of bile acid on lipid metabolism and FXR expression in rat model of hepatectomy.MethodsRats were divided into group1 (fed with normal diet), group2 (normal diet plus 0.2% bile acid) and group3 (normal diet plus 50% glucose). There were 10 rats in each group. At day 7, rats were subjected to 70% hepatectomy. At 72 h postoperation, the mRNA and protein levels of SHP, CYP7A1, BSEP were detected by RT-PCR and Western blot, triglyceride (TG) and cholesterol (TC) levels in the liver cells were detected by kit.ResultsExpressions of SHP, BSEP were increased while CYP7A1 decreased significantly (P<0.05) in the group2 contrary to group3 (P<0.05) comparing to group1. TG level was decreased in group2 and increased in group3, on the contrary, level of TC was increased in group2 and decreased in group3, the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionsBile acid could promote regeneration of liver cell, FXR plays an important role in the regulation of hepatocyte metabolism.

【Key words】FXR; Lipid metabolism; Liver regeneration

肝再生是肝脏组织损伤后修复的过程，研究表明肝脏的再生不需有干细胞的参与，而是由分化成熟的和大量休眠的肝细胞增殖完成，其具体机制虽尚不清晰，但已表明是由细胞活化、脂质代谢和细胞分裂共同构成的细胞反应〔1〕，在手术、创伤、中毒、感染、坏死及肝移植等所致的肝损伤恢复过程中发挥着重要的作用。胆汁酸由胆固醇合成，后者也是其重要成分。研究表明胆汁酸参与了肝再生过程。法尼醇X受体(FXR)为主要表达于肝脏、肠道、肾脏和肾上腺的一种代谢性核受体，能够通过多种途径调节胆汁酸和胆固醇的代谢，FXR还能够调控肝再生过程中的能量代谢平衡而影响肝再生〔2，3〕。本研究将对胆汁酸在肝再生过程中的脂质代谢及其与FXR表达的关系进行探讨，以期为肝损伤修复的研究提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂大鼠购于佳木斯大学实验动物中心；胎牛血清、DMEM培养液购自Hyclone；总RNA提取试剂盒、TIAN Script RT Kit、2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技有限公司；小异二聚体伴侣(SHP)、胆固醇7α-羟化醇(CYP7A1)抗体购自Santa cruz；胆盐输出泵(BSEP)抗体购自abcam；甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；引物委托生工生物(上海)有限公司合成；其他试剂为国产分析纯。

1.2实验动物及实验分组建立部分肝切除大鼠模型，术前大鼠禁食12 h，不禁水，随机分成G1组(正常喂养)，G2组(给予0.2%胆酸喂养)，G3组(正常饮食中加入50%葡萄糖)，每组10只，喂养后7 d切除大鼠70%肝组织，分别于术后72 h取出肝组织及血液标本，检测相关指标。

1.3增殖细胞核抗原(PCNA)测定新鲜肝脏样本立即在中性甲醛溶液固定。石蜡切片，内源性过氧化物酶和3%过氧化氢(上海化学试剂国药控股，中国)阻断、封闭。添加鼠单克隆抗体对PCNA(sc-252820；1∶50；美国Santa cruz)孵化，4℃过夜。添加HRP-鼠标抗体(1∶200；A0216中国Beyotime生物技术研究所)孵化30 min 37℃。二氨基联苯胺染色2 min后滴加苏木素复染1 min，分化、封片。

1.4RT-PCRTRIzol法提取细胞总RNA，并按照TIAN Script RT Kit试剂盒说明书逆转录成cDNA。分别设计并合成SHP、CYP7A1、BSEP、β-actin引物序列如表1。PCR反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳凝胶成像后以β-actin为内参进行灰度分析。

表1　引物信息

1.5Western印迹肝细胞提取后加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白并调平。取总蛋白40 μg，加入上样缓冲液煮沸5 min，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，加入稀释一抗(SHP 1∶100，CYP7A1 1∶100，BSEP 1∶1 000，Caveolin-1 1∶2 000)4℃孵育过夜，PBS洗膜3次，加入稀释二抗37℃孵育15 min。电化学发光(ECL)法进行底物发光，于暗室中曝光成像。

1.6TG和TC含量的测定提取肝细胞后加入0.25%胰酶消化并计数，反复冻融法裂解细胞，加入异丙醇萃取TG和TC，10 000 r/min离心5 min，取上清。按照试剂盒说明书分别检测。

1.7统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1胆酸对肝再生的影响与G1组比较，G2组肝细胞增殖显著增高(P<0.05)，G3组则有所下降(P<0.05)。见图1。

图1　各组PCNA的表达变化(×40)

2.2胆酸对脂质代谢相关蛋白的影响与G1组相比，G2组SHP和BSEP mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01，P<0.01)，CYP7A1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01)，G3组SHP和BSEP mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01，P<0.05)，CYP7A1 mRNA和蛋白显著升高(P<0.01)。G2和G3组上述指标亦差异显著(P<0.05)。见图2。

与G1组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与G2组比较：3)P<0.05 图2　各组SHP、CYP7A1、BSEP mRNA和蛋白的表达

2.3胆酸对TG、TC含量的影响与G1组相比，G2组TC含量显著降低(P<0.05)，TG显著升高(P<0.01)，G3组TC含量显著升高(P<0.05)，而TG显著降低(P<0.01)。G2和G3组上述指标差异显著(P<0.05)。见表2。

表2　各组细胞内TG和TC的含量比较

与G1组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与G2组比较：3)P<0.05

3讨论

肝脏的再生不需有干细胞的参与，而是由分化成熟的和大量休眠的肝细胞增殖完成，实现自我再生是临床肝受损后恢复的重要生理过程，所以提高肝的再生能力对于肝损伤的修复具有重要作用。肝再生过程启动了一连串的因子及基因活化，同时激发各种物质代谢及细胞活化机制：如脂类代谢、细胞分裂等。肝脏再生必须依赖于能量代谢的正常进行，其中胆汁酸为胆固醇经肝脏代谢的终产物，能够反映肝细胞的合成以及代谢状态。体外研究表明，生理浓度的胆汁酸能够促进肝细胞增殖〔4，5〕，然而超负荷的胆汁酸能够引起肝细胞变性坏死〔6~8〕，既往研究表明，FXR基因敲除小鼠行70%肝切除后，肝再生明显受到抑制，FXR对胆汁酸代谢的调控在肝再生过程中发挥着重要的作用〔9，10〕。

FXR被激活后，能够促进SHP表达〔11〕，SHP进一步与肝脏相关同系物(LRH)结合，抑制CYP7A1转录〔12〕，CYP7A1是胆固醇转化为胆汁酸主要途径的限速酶〔13〕，CYP7A1表达的抑制降低了胆固醇向胆汁酸的转化，减轻了剩余肝脏的胆汁酸负荷，促进了肝再生。BSEP也为FXR的靶基因，具有调控肝细胞内胆汁酸浓度的作用。本研究提示脂类代谢参与了肝再生过程。适度的胆酸促进了TG、TC的代谢，减少了肝组织内脂类堆积，减轻了肝脏毒性，而葡萄糖过载却加重了脂类对肝细胞毒性，损伤了肝再生。证明葡萄糖过载并不能促进肝细胞再生反而会抑制肝再生〔14〕。

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14Urizar NL，Liveryman AB，Dodd’s DT，etal.A natural product that lowers cholesterol as antagonist ligand for FXR〔J〕.Science，2002；296：1703-6.

〔2014-01-17修回〕

(编辑苑云杰)