前列腺干细胞抗原基因和磷脂酶CE1基因多态性与老年幽门螺旋杆菌感染胃溃疡的易感性及对临床预后的影响

前列腺干细胞抗原基因和磷脂酶CE1基因多态性与老年幽门螺旋杆菌感染胃溃疡的易感性及对临床预后的影响

卢燕刘丽凤曾莎芦莉1陶惠敏

(聊城市人民医院，山东聊城252000)

摘要〔〕目的探讨前列腺干细胞抗原基因(PSCA)和磷脂酶(PL)CE1基因多态性与老年幽门螺旋杆菌(Hp)感染胃溃疡的易感性及对临床预后的影响。方法采用病例-对照研究设计，选取130例胃溃疡并且Hp检查为阳性的老年患者作为病例组，另外按性别和年龄匹配的胃溃疡并且Hp检查为阴性的老年患者作为对照组。所有患者治疗前抽取外周静脉血并提取DNA，设计PSCA(rs2294008)和PLCE1(rs11599672)聚合酶链反应(PCR)引物进行PCR扩增，扩增产物采用DNA 测序分析PSCA和PLCE1基因类型，采用Logistic回归计算校正相对危险度(OR)和95%置信区间(95%CI)评价PSCA和PLCE1基因多态性与老年Hp感染胃溃疡的易感性。结果①两组年龄、性别、病程、病变部位差异均无统计学意义(P>0.05)；②与rs2294008基因型CC比较，基因型为CT、TT和CT/TT的患者Hp感染危险性降低(P<0.01)；③与PLCE1 rs11599672基因型AA比较，基因型为AC、CC和AC/CC的患者Hp感染危险性降低(P<0.05)；④不同PSCA多态位点rs2294008和LCEl多态位点rs11599672患者的Hp根除率和溃疡愈合率差异具有统计意义(P<0.01)。结论PSCA rs2294008基因型CC和PLCE1 rs11599672基因型AA可增加Hp感染胃溃疡易感性，并且显著降低临床预后。

关键词〔〕幽门螺旋杆菌感染；胃溃疡；基因多态性；前列腺干细胞抗原基因；磷脂酶CE1

中图分类号〔〕R573.3〔文献标识码〕A〔

基金项目：山东省自然科学基金联合专项(No.ZR2014HL019)

通讯作者：曾莎(1980-)，女，硕士，主管检验师，主要从事肿瘤、免疫研究。

1聊城市复退军人医院

第一作者：卢燕(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事消化内镜下的各种病变诊治，炎症性肠病及消化道肿瘤诊治研究。

幽门螺旋杆菌(Hp)具有高感染性，是胃黏膜病变的重要致病因素。Hp可引起胃肠道的持续感染并诱发持续的轻度炎症反应从而导致慢性胃溃疡，并且与胃癌的发生密切相关〔1〕。此外，Hp感染与动脉粥样硬化、心血管疾病等有显著相关性〔2〕。Hp致病机制复杂，与Hp易感性有关的人类基因也被不断报道〔3〕。单核苷酸多态性(SNP)是疾病易感性差异的遗传基础，作为常见的遗传标志已被广泛应用于各种疾病的发病风险及预后评价的相关性研究。最近的全基因关联研究报道了前列腺干细胞抗原基因(PSCA)和磷脂酶(PL)CE1基因多态性与胃癌易感性的关系，但是关于PSCA和PLCE1基因多态性与Hp感染胃溃疡的易感性和临床预后却鲜有报道。本文探讨PSCA和PLCE1与Hp感染胃溃疡易感性和临床预后的关系。

1资料与方法

1.1一般资料2013年1月至2014年12月我院消化内科确诊为胃溃疡并且Hp检查为阳性的130例老年患者为病例组及按年龄和性别匹配确诊为胃溃疡并且Hp检查为阴性的130例老年患者为对照组。两组年龄、性别、病程、病变部位差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1　两组临床资料比较

1.2诊断标准胃溃疡诊断经胃镜检查及病理学确诊；Hp检查以测定胃镜检查时取的活检标本分别行快速尿素酶试验、组织学检查，两者均为阳性者作为Hp感染阳性，两者均为阴性为Hp感染阴性。

1.3纳入排除标准纳入标准：①均为首诊；②符合胃溃疡诊断标准；③符合Hp感染阳性。排除标准：①胃溃疡病史或治疗史的患者；②合并活动性出血、穿孔或幽门梗阻的患者；③治疗前4w内服用过质子泵抑制或H2受体拮抗剂、铋剂、抗生素药物的患者；④并发严重心、脑、肝、肾和造血系统疾病患者。

1.4SNP测定方法治疗前抽取外周静脉血于EDTA抗凝管，提取DNA，设计PSCA(rs2294008)和PLCE1(rs11599672)PCR引物进行PCR扩增，扩增产物采用DNA测序分析基因型进行PSCA和PLCE1基因多态性测定。

1.4.1DNA的提取、测定与调整采用QIAGENDNA抽提试剂盒(德国TAINGEN公司)进行血液DNA提取。取所提取的基因组DNA2μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，1%琼脂糖溴乙锭染色，使用紫外反射透射分析仪(上海金鹏)对凝胶照相以观察DNA的完整性。采用紫外可见分光光度仪(德国Eppendorf公司)测定所提取基因组DNA的浓度和纯度，标本均满足标准值OD260nm/OD280nm=1.7～2.0，根据估计的浓度将样本DNA的浓度稀释到工作浓度5～10ng/μl，-80℃保存备用。

1.4.2PCR反应以基因组序列为依据，设计PSCA(rs2294008)和PLCE1(rs11599672)PCR引物，各引物序列见表1。PCR反应体系及扩增条件：PCR反应总体系为25μl，含100μg/LDNA模板2μl，10×缓冲液215μl，25mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTP2μl，10μmol/L引物正反向各1μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.25μl，灭菌蒸馏水至25μl。反应在ABI9700PCR仪(美国ABI公司)中进行，条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。取PCR产物2μl并以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，然后GeneGenius全自动凝胶成像系统(美国Syngene公司)中扫描分析结果。

表1　引物序列及产物长度

1.4.3SNP分型利用虾碱性磷酸酶(美国SEQUENOM公司)去除PCR后剩余的dNTP，以保证单碱基延伸的准确性，并且经离子交换树脂(美国SEQUENOM公司)纯化。96孔板中加入1μl上述纯化延伸产物、GenescanTM-120LIZSizeStandard(美国AppliedBiosystems公司) 0.5μl和去离子甲醜胺8.5μl混合均匀后，95℃变性5min，然后在ABIPRISMTM3700DNAAnalyzer(美国AppliedBiosystems公司)上使用仪器默认的3700 测序程序进行电泳、扫板。采用GeneMapper4.1(美国AppliedBiosystems公司)进行原始数据分析。

1.5胃溃疡临床疗效评价胃溃疡并且Hp检查为阳性的患者接受PPI法(奥美拉唑20mg+克拉霉素0.5g+阿莫西林1.0g)，2次/d，口服1w，然后继续进行4w正规抗溃疡治疗(PPI联合胃黏膜保护剂)，停药1个月后复查胃镜，观察分析患者Hp根除率及溃疡愈合率。Hp复查为阴性则为Hp根除，Hp根除率(%)=(治疗后Hp阴性患者数量/患者总数)×100%。溃疡愈合标准如下：溃疡及周围炎性反应全部消失为痊愈；溃疡愈合、溃疡周围仍伴有炎症为显效；溃疡大小(直径)缩小≥50%为有效；溃疡缩小<50%或无变化或增大者为无效。溃疡愈合总有效率(%)=〔(治愈+显效+有效)/患者总数〕×100%。

1.6统计学方法应用χ2检验和t检验，采用拟合优度检验进行Hardy-Weinberg平衡检验，多因素Logistic回归计算OR值及其95%CI以表示相对危险度。

2结果

2.1PSCA基因多态性对Hp感染易感性的分析PSCA多态位点的基因频率在病例组和对照组均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)，说明选取的样本具有代表性。病例组PSCA多态位点rs2294008基因类型CC、CT和TT分布频率与对照组差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。多因素Logistic回归分析，调整年龄、性别、病程、病变部位等变量后，与rs2294008基因型CC比较，基因型为CT、TT和CT/TT的患者Hp感染危险性降低(P<0.01)。

表2　 PSCA基因多态性与 Hp感染的关系〔n(%),n=130〕

2.2PLCE1基因多态性对Hp感染易感性分析PLCE1多态位点的基因频率在两组均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)。病例组PLCE1多态位点rs11599672基因类型AA、AC和CC分布频率与对照组差异显著(P<0.05)。见表3。多因素Logistic回归分析，调整年龄、性别、病程、病变部位等变量后，与PLCE1rs11599672基因型AA比较，基因型为AC、CC和AC/CC的患者Hp感染危险性降低(P<0.05)。

2.3PSCA和LCEl基因多态性对Hp根除和溃疡愈合率的关联性分析经治疗后，病例组Hp根除率为76.92%，溃疡愈合率为82.31%。不同PSCA多态位点rs2294008和LCEl多态位点rs11599672患者的Hp根除率和溃疡愈合率差异具有统计意义(P<0.01)。见表4。

表3　 PLCEl基因多态性与 Hp感染的关系〔n(%),n=130〕

表4　 PSCA和 LCEl基因多态性对 Hp根除和溃疡愈合率的关联性分析〔n(%)〕

3讨论

Hp是全球性高感染率的慢性感染性致病菌〔4〕。中国属Hp高感染率国家，其感染率为40%～70%，与气候、居住环境、饮食、家族遗传等因素密切相关〔5〕。Hp感染是引起消化性溃疡的重要病因，在十二指肠溃疡中检出率为95%～100%，在胃溃疡中检出率为70%～85%〔6〕。Hp感染既是消化性溃疡发病及复发的主要因素，同时也是胃癌的重要危险因子之一〔7〕。Hp可分泌分泌CagA蛋白等细胞毒性蛋白，CagA蛋白能参与激活核因子κB通路，导致各种炎症介质增多，从而诱发胃黏膜炎症反应而导致胃溃疡的发生，甚至诱发胃黏膜组织癌变〔8〕。消化性胃溃疡可能是胃癌重要的癌前状态。

PSCA是前列腺癌诊断和判断预后的重要生物学指标〔9〕。PSCA也可在胰腺癌、肾透明细胞癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌等高表达，其表达水平与肿瘤发生、进展、转移及预后密切相关〔10〕。有研究〔11〕显示，PSCA表达与胃癌侵袭能力、淋巴结转移及远处器官转移有密切关系，提示PSCA表达可能是反映胃癌生物学行为和预后的重要标记物。PLCE1是磷脂酶C的蛋白质家族的成员，在细胞内信号转导发挥重要作用，可通过催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸产生第二信使三磷酸肌醇和二酯酰甘油。另外，PLCE1包含几个Ras相互作用的区域〔12〕，可与ras原癌基因相互作用，同时结合Ras家族鸟苷三磷酸酶，参与细胞的生长、分化、凋亡和血管生成，与动物皮肤、肠道肿瘤的形成有关〔13〕。

本研究结果说明PSCArs2294008基因型CC和PLCE1rs11599672基因型AA可增加Hp感染胃溃疡易感性的风险。PSCA和PLCE1基因多态性影响胃溃疡患者的临床预后，PSCArs2294008基因型CC和PLCE1rs11599672基因型AA可显著降低胃溃疡的临床预后。

4参考文献

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3SchnellerJ，GuptaR,MustafaJ，et al.Helicobacterpyloriinfectionisassociatedwithahighincidenceofintestinalmetaliasiainthegastricmucosaofpatientsatinner-cityhospitalsinNewYork〔J〕.DigestDisSci，2006;51(10)：1801-9.

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6林小兰，李珍，谢亨银.两种根治幽门螺旋杆菌相关消化性溃疡方案的成本-效果分析〔J〕.广东医学，2012;33(6)：844-6.

7XiaX，ZhiFL，MingF，et al.HelicobacterpylofiCagAinducesornithinedecarboxylaseupregulationviaSrc/MEK/ERK/c-Mycpathway：implicationforprogressionofgastricdiseases〔J〕.ExpBiolMed，2012：237(4):435-11.

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9ZhiYZ，WenLS.Externalbeamradiotherapy(EBRT)suppressedprostatestemcellantigen(PSCA)mRNAexpressionclinicallylocalizedprostatecancer〔J〕.Prostate，2007;67(6)：653-66.

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11姚宏亮，杨竹林，李永国.胃良恶性病变组织中PSCA和Oct-4的表达及意义〔J〕.中南大学学报(医学版)，2008;33(7)：623-6.

12YadavV，YanezNC，FentonSE，et al.LossofproteinkinaseCdeltageneexpressioninhumansquamouscellcarcinomas:alasercapturemicrodissectionstudy〔J〕.AmJPathol，2010;176(3)：1091-6.

13宋昕，周福有，张连群，等.食管鳞状细胞癌PLCE1基因多态性与吸烟、饮酒及体质量指数的相关性〔J〕.河南大学学报(医学版)，2012;31(3)：186-90.

〔2014-07-17修回〕

(编辑苑云杰)