瑞舒伐他汀对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块中凋亡相关蛋白的影响

瑞舒伐他汀对ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块中凋亡相关蛋白的影响

陈建昌高国洁李凤玲郝跃伟刘伟魏金省

(山东大学附属省立医院急诊科，山东济南 250022)

摘要〔〕目的观察瑞舒伐他汀对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3表达的影响。方法10只C57小鼠作为对照组，给予普通饮食，同品系22只ApoE-/-小鼠随机分为模型组(n=11)、干预组(n=11)，高脂喂养8 w后，干预组给予瑞舒伐他汀悬液灌胃，模型组给予等量生理盐水。继续喂养12 w后所有老鼠处死，全自动生化仪检测血清血脂，光学显微镜观察各组小鼠主动脉斑块形态及面积，免疫组化法检测动脉粥样斑块Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果与对照组相比较，模型组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显升高(P<0.05)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显降低(P<0.05)；主动脉可见明显粥样斑块；Bcl-2表达明显减少，Caspase-3表达明显增多(P<0.05)。与模型组比较，TC、TG、LDL-C明显降低(P<0.05)；干预组小鼠动脉粥样斑块面积减小(P<0.05)， Bcl-2表达明显增多，Caspase-3表达明显减少(P<0.05)。结论高脂饮食可引起ApoE-/-小鼠主动脉凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3的变化，瑞舒伐他汀可以通过上调Bcl-2、下调Caspase-3的表达，抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的进展。

关键词〔〕瑞舒伐他汀； ApoE-/-小鼠； 动脉粥样硬化；Bcl-2； Caspase-3

中图分类号〔〕R541.4〔文献标识码〕A〔

第一作者：陈建昌(1962-)，男，副主任医师，主要从事急诊急救医学研究。

动脉粥样硬化(AS)发生发展中，高脂质负荷及氧化修饰和炎症差异调节着血管细胞的增殖、凋亡〔1〕。AS斑块中常检测到大量巨噬细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞的凋亡，造成内皮功能障碍，脂质核心增大，斑块纤维帽变薄，形成不稳定斑块，易发生急性冠脉综合征(ACS)〔2〕。他汀类药物最初作为强有效的调脂药物应用于临床，最新研究表明其可通过抗炎、抗氧化等作用稳定斑块，延缓甚至逆转斑块进展，其独立于调脂以外的作用机制已成为研究热点，目前仍有新的作用机制被发现，其是否也通过调控凋亡相关基因抑制细胞凋亡从而稳定斑块，尚不清楚。Bcl-2蛋白是体内外凋亡信号转导通路的重要调节器，尤其在氧化应激和炎症导致的血管细胞凋亡中起重要调节作用〔1〕。本实验通过检测瑞舒伐他汀对小鼠AS斑块中凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3表达的影响，探究他汀类药物对AS斑块内细胞凋亡的作用，为寻找AS新的治疗靶点和干预措施提供了新思路。

1材料与方法

1.1材料与仪器雄性C57BL/6J小鼠、同品系ApoE-/-小鼠购自北京大学医学部实验动物科学部，动物合格证号：SCXK(京)2011-0012。高脂及普通饲料购自山东大学医学部。瑞舒伐他汀钙片(批号：H20060406)由阿斯利康制药有限公司生产，用生理盐水配置成悬液。一抗：Bcl-2、Caspase-1兔抗小鼠单克隆抗体购自美国Immunoway，公司，二抗辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG多聚体、血脂测试试剂盒、PV9000免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自青岛昊航科贸有限公司，显微镜摄像机、光学显微镜、切片机、全自动血生化仪用自山东大学医学部。

1.2方法

1.2.1小鼠模型与分组健康雄性8周龄C57小鼠10只，体重(18.4±3.1)g为对照组，给予普通饲料喂养，同一品系健康雄性8周龄ApoE-/-小鼠22只，体重(19.2±2.3)g，普通饲料适应性喂养1 w后，将ApoE-/-小鼠随机分为模型组与干预组，每组11只，均给予高脂饲料，喂养8 w后，给予干预组瑞舒伐他汀钙悬液10 mg·kg-1·d-1灌胃，每次灌胃量0.2 ml，普通组给予等量生理盐水灌胃，ApoE-/-小鼠继续高脂饲料喂养，对照组普通饲料喂养，饮水不限制，持续12 w，其中模型组因撕咬死亡1只，干预组因灌胃窒息死亡1只。

1.2.2血脂测定最后一次给药后，所有小鼠禁食水12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，眼球取血，每只小鼠取血量约0.5 ml左右，静置2 h后以6 000 r/min，10 min高速离心，取上层血清，使用全自动血生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.2.3病理形态学检查取完血后快速打开小鼠胸腹腔，由主动脉根部离断血管，游离整个主动脉剪断，冰生理盐水冲洗，快速放入4%中性多聚甲醛内固定12 h。常规石蜡包埋、切片，苏木精伊红(HE)染色，光学显微镜下观察，Image-Pro Plus Version 6.0(IPP)图像分析处理软件计算小鼠管腔面积和斑块面积。

1.2.4Bcl-2、Caspase-1免疫组化检测取完血后取主动脉，用冰生理盐水冲洗，4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，以5 μm厚度切片，脱蜡、水化，放入抗原修复液中，将容器异同放入高压锅中加热行高压抗原修复，冷却至室温，PBS洗3次，3% H2O2去离子水孵育10 min，分别滴加一抗 Bcl-2、Caspase-1(1∶100)，4℃过夜，滴加二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG多聚体，室温孵育20 min，PBS冲洗、DAB显色后进行苏木素核复染，脱水、透明、封片。显微镜下观察，每张切片随机选取4个视野，Bcl-2、Caspase-1均以胞质中出现棕黄色为阳性表达，观察并拍照，计算阳性细胞表达量，取其平均值。

1.3统计学分析采用SPSS15.0软件行配对t、χ2检验及F检验。

2结果

2.1各组小鼠血脂检测模型组ApoE-/- 小鼠TC、TG、LDL-C水平均高于对照组(P<0.05)，HDL-C水平低于对照组(P<0.05)。干预组ApoE-/-小鼠TC、TG、LDL-C水平均低于模型组(P<0.05)，HDL-C水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组小鼠血脂水平的比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2小鼠血管壁病理改变HE染色显示对照组小鼠主动脉内膜光滑无中断，中膜、外膜分界清晰，与内膜平行，细胞排列规则。模型组小鼠主动脉壁层次尚清晰，内膜明显增厚，向管腔突出，内皮细胞坏死、脱落造成内膜中断。中膜平滑肌细胞大量增殖，排列紊乱，侵入内膜下，形成粥样斑块，内见大量泡沫细胞及坏死灶。干预组较模型组内膜增厚减轻，斑块明显缩小，病变程度减轻。见图1，表2。

表2　各组小鼠主动脉斑块和管腔面积比较 ± s, n=10)

2.3小鼠主动脉Caspase-3 、Bcl-2 免疫组化检测对照组主动脉细胞胞质有少量棕黄色颗粒物表达。模型组与干预组均可见棕黄色Caspase-3 、Bcl-2 阳性表达。与对照组相比，模型组平滑肌细胞内、粥样斑块中Caspase-3 表达明显增加，Bcl-2 阳性表达减少但无统计学意义；与模型组相比，干预组平滑肌细胞、粥样斑块内Bcl-2阳性细胞表达明显增加(P<0.05)，Caspase-3阳性细胞表达减少(P<0.05)。见图1、图2，表3。

图1　小鼠主动脉Caspase-3表达(DAB，×400)

图2　小鼠主动脉Bcl-2表达(DAB，×400)

组别Caspase-3Bcl-2对照组7.1±2.25.2±1.2模型组15.6±2.31)4.2±1.5干预组10.5±2.32)9.6±3.42)

3讨论

细胞凋亡是肿瘤、糖尿病等疾病的发生机制之一，近年来观察发现，凋亡也广泛参与AS的发生。研究表明AS斑块浸润大量炎性细胞并且易发生细胞凋亡，导致脂质核心的形成〔3〕。血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞的凋亡促进脂质沉积，核心增大，形成易损斑块〔4〕。内皮损伤是AS发生的起始环节〔5〕，据报道内皮细胞的凋亡导致AS斑块不稳定性，易血栓形成，导致ACS〔6〕。氧自由基或细胞内氧化代谢产物可以攻击多不饱和脂肪酸，启动脂质过氧化链式反应，其中最主要的是LDL被氧化成ox-LDL，ox-LDL与内皮细胞上过表达的受体LOX-1结合，使 p38MAPK 磷酸化，激活Caspase-3，诱导NF-κB转位到核膜，直接或间接的促进Caspase-3的活化并下调bcl-2的表达，使内皮细胞受损〔7〕，分泌功能紊乱，导致内皮细胞凋亡，抗氧化能力减弱。

巨噬细胞凋亡同样参与AS进展，富含巨噬细胞区域比如斑块的“肩部”细胞凋亡通常要高于其他区域〔8〕，巨噬细胞吞噬过多的ox-LDL，发生凋亡后如未能及时被清除则发生继发性坏死，坏死细胞碎片同时也是强烈的促炎因子，可诱发一系列炎症反应，造成斑块不稳定性，易破裂导致ACS。Hartung等〔9〕制备了晚期AS斑块模型，然后给予他汀类凋脂治疗，观察到粥样硬化斑块巨噬细胞炎性浸润减少和血管平滑肌细胞含量增加，而巨噬细胞凋亡明显减少，从而表明巨噬细胞凋亡减少可能有助于斑块的稳定。Bcl-2 在AS斑块平滑肌细胞中共表达，可与Bax 凋亡基因拮抗，调节平滑肌细胞的基质分泌，阻止凋亡过度表达而使斑块稳定。

细胞凋亡有两条诱导通路，一个是死亡受体通路另一个是细胞应激途径。这两条通路都起始于Caspase-3的激活〔10〕因此Caspase-3被认为是细胞凋亡的关键酶。线粒体在Caspase活化诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。线粒体释放细胞色素C到胞质， 使前体Caspase-3 (32 kD)被激活，进一步被切割为两部分：p17片段(17 kD) 和p12 片段(12 kD)。Caspase通过识别核糖聚合酶PARP的裂解片段，诱导凋亡〔11〕。

Bcl-2 基因家族，是最重要的细胞凋亡控制基因，其编码的Bcl-2抗凋亡蛋白，可以阻止化疗药物、紫外线辐射、自由基损伤导致的细胞凋亡〔12〕。Bcl-2家族可以调控巨噬细胞凋亡〔13〕。Bc l-2和Bax均属于Bcl-2基因家族，促凋亡蛋白Bax可以插入线粒体外膜，进入线粒体触发凋亡因子释放，如细胞色素C。同时，抗凋亡蛋白Bcl-2可以阻止线粒体分解及细胞色素C的释放，从而组织细胞凋亡。Bai等〔14〕发现上调Bcl-2的表达可以减少细胞色素C的释放，抑制oxLDL导致的巨噬细胞凋亡。Bcl-2对Caspase有抑制作用，参与对Caspase活性的调节，可抑制过度表达Caspase-3所诱导的细胞凋亡。研究表明Bcl-2蛋白环区的天冬氨酸(Asp34)是Caspase-3的酶解位点，Bcl-2对细胞凋亡的抑制同时受到Caspase-3的调节，Caspase-3能够在Asp34的位置切割Bcl-2蛋白使其发生裂解，被裂解的Bcl-2可以向线粒体外膜转移，通过BH3和跨膜结构域进而上调细胞凋亡过程。

本实验成功通过高脂喂养AproE-/-小鼠构建动物AS模型，进行瑞舒伐他汀干预可以明显减小主动脉AS斑块，与Hartung等〔9〕研究一致。本研究表明，与对照组相比，通过免疫组化法检测主动脉壁Bcl-2、Caspase-3的表达，发现模型组小鼠主动脉Caspase-3、Bcl-2均有表达，Caspase-3表达明显增多，阳性细胞多聚集于粥样硬化斑块附近，尤其是脂质核心和粥样斑块纤维帽肩部，而在正常小鼠血管壁内很少见到阳性细胞，说明在动脉粥样硬化发生过程中，细胞凋亡发生频繁，并激活抗凋亡蛋白。这可能是由于机体异常高脂血症，促进前体Caspase-3分割成有活性的Caspase-3，Caspase-3可以使Bcl-2酶解，减少了内皮细胞 Bcl-2的表达，从而导致血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞的凋亡。与模型组相比较，瑞舒伐他汀干预组小鼠凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高，在血管内膜、中膜均有表达，说明瑞舒伐他汀可能通过减少Caspase-3的活化并增加Bcl-2 的表达，改善血管细胞凋亡情况，减少内皮细胞受损，抑制平滑肌细胞凋亡，减少巨噬细胞凋亡，稳定斑块，延缓动脉粥样硬化的发生。但本实验样本数量有限，调节调节Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达的分子机制还不十分清楚，应用于临床还有一定距离。

4参考文献

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〔2014-09-19修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)