大剂量当归预适应抗心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的机制

大剂量当归预适应抗心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的机制

陈彦文1明海霞2刘喜平王强1高晓兰1郭超1赵英1

(甘肃中医学院解剖教研室甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃兰州 730000)

摘要〔〕目的观察大剂量当归水煎液预适应对缺血再灌注(IR)大鼠心肌细胞凋亡及心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达的影响。方法应用离体灌流大鼠心脏，复制大鼠心肌IR与缺血预适应(IPC)模型，并以不同大剂量当归水煎液灌胃6 w后，取大鼠心脏进行离体灌注，复制当归IPC模型，以TTC法测定心肌梗死面积，以Tunel法检测细胞凋亡，Western印迹法检测Bcl-2及Bax蛋白表达。结果大剂量当归水煎液预适应能有效降低IR大鼠心肌梗死面积，降低心肌细胞的凋亡率，并增加心肌组织Bcl-2的表达而抑制Bax的表达，且呈现明显剂量-效应关系(P<0.05，P<0.01)。结论大剂量当归水煎液预适应可增加心肌组织Bcl-2的表达而抑制Bax的表达，从而减少IR大鼠心肌细胞的凋亡，对IR大鼠心肌具有明显保护作用。

关键词〔〕当归水煎液；缺血再灌注；细胞凋亡；Bcl-2：Bax

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：甘肃省教育厅

通讯作者：刘喜平(1972-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事中药复方配伍及敦煌古医方研究。

1甘肃中医学院生理教研室甘肃省中药药理与毒理学重点实验室

2甘肃中医学院方剂教研室

第一作者：陈彦文(1969-)，男，副教授，主要从事中西结合防治心脑血管疾病基础研究。

心肌缺血是冠心病的基本病理过程，尽早恢复血供能够挽救缺血心肌，但再灌注则引起缺血再灌注(IR)损伤。缺血预适应(IPC)是心肌保护的新概念，是迄今为止最强的内源性心肌缺血保护方法。水煎口服是中医临床常见给药途径，前期研究表明，大剂量岷当归水煎液预适应可减少或防止大鼠心肌IR室性心律失常的发生，从而减轻IR心肌损伤，对心肌IR后大鼠心功能具有明显保护作用，但其作用机制不是十分明确〔1〕。本研究对IPC心肌IR大鼠给予不同大剂量当归水煎液治疗， 从细胞凋亡的角度探讨大剂量当归对IR损伤的药理学预适应作用及机制。

1材料与方法

1.1动物SPF级健康成年雄性SD大鼠40只，体重(200±20)g，由甘肃中医学院科研实验中心实验动室提供，实验设施使用证SYXK(甘)2009～0006，实验动物质量合格证SCXK(甘)2009～0006。

1.2 药品及试剂当归药材由兰州复兴厚药材有限公司提供，经鉴定符合药典规定；当归水煎液采用常规煎煮方法，浓缩为1 g/ml；TTC染液购自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax福建迈新试剂公司产品。

1.3方法

1.3.1动物分组及模型建立SD大鼠麻醉同时腹腔注射肝素，随机分为5组，每组8只。开胸取心脏置于冷灌流液中，主动脉逆行插管连接在 Langendorff 离体灌流装置上，以80 mmH2O 的压力KH缓冲液灌流心脏，用95%O2和5%CO2混合气体平衡灌流液。

IR组：大鼠心脏先预灌注平衡 20 min，然后在无灌流液、无氧的条件下，保持心脏温度恒定在37℃，停止灌流40 min(缺血)，之后再复灌120 min(再灌)；IPC组 ：大鼠心脏先预灌注平衡20 min ，再经短暂的5 min缺血，10 min 再灌注， 重复3 次之后，心脏再经历 40 min 的缺血，120 min的再灌注；当归小剂量水煎液+缺血预适应组 ( DL-IPC组) ：给予大鼠当归小剂量水煎液0.54 g/d(相当于人剂量的30 g)灌胃给药6 w后，麻醉动物，迅速取心脏连接到离体心脏灌流装置上，复制心脏IPC 模型(方法同IPC组 )；当归中剂量水煎液+缺血预适应组 (DM-IPC) ：给予大鼠当归中剂量水煎液1.08 g/d(相当于人剂量的60 g)灌胃给药，其余操作同DL-IPC组；当归大剂量水煎液+缺血预适应组(DH-IPC)：给予大鼠当归大剂量水煎液2.16 g/d (相当于人剂量的120 g)灌胃给药，其余操作同DL-IPC组。

1.3.2 TTC染色法测定心肌梗死面积心脏灌流结束后取下心脏，置于-20℃冷冻2 h ，然后，沿从心尖到心底方向，将心脏切成 4 mm厚的切片，将心肌切片置于 2%TTC染液中，37℃孵育20 min，再将切片用10%的甲醛溶液固定。镜检观察，非梗死区染为红色，梗死区呈苍白色，红色区与苍白色区之间为缺血区。拍照后，用计算机图像分析系统，计算分析梗死区的面积。

1.3.3 TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡取心室肌组织，切成0.5 cm3的小块，用4%多聚甲醛磷酸固定，常规脱水、浸蜡、包埋，制成厚度为10 μm的切片，用光镜观察细胞凋亡情况。正常心肌细胞核染成蓝色，凋亡的细胞核呈棕褐色。每张切片随机选择5个视野，光镜下放大200倍，记录阳性染色的心肌细胞数及心肌细胞总数，按以下公式计算凋亡指数(AI)：AI=阳性细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.3.4 Western印迹法检测心肌组织Bcl-2与Bax的表达取大鼠心脏组织，提取组织蛋白质，保存备用。超微量分光光度计测蛋白质浓度；取100 μl上清液(细胞裂解液)，取相同质量的细胞裂解液，并加等体积的电泳加样缓冲液，沸水浴中3 min，上样、电泳(浓缩胶20 mA，分离胶35 mA)，电转膜仪转膜(100 mA 40 min)。膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色Western印迹ECL试剂盒显色，在成像系统上成像记录结果。以Bcl-2、Bax蛋白及β-actin的比值进行半定量分析。

1.4 统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积及心肌细胞AI的变化见表1。与IR组相比，IPC组的梗死面积及心肌细胞AI显著降低(P<0.05)；与IPC组的梗死面积比较， 不同剂量当归预处理组的梗死面积及心肌细胞AI均显著降低，且有显著的剂量-效应关系 (P<0.05，或P<0.01)。

2.2 各组大鼠心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达见表2、图1。与IR组相比，IPC组Bcl-2蛋白的表达增多，Bax的表达减少(P<0.05)。与IPC组比较， 不同剂量当归预处理组的Bcl-2蛋白的表达增多，Bax蛋白的表达减少，且有显著的剂量-效应关系，以DH-IPC组效应最为显著 (P<0.05，P<0.01)。

表1　各组大鼠心肌梗死面积及心肌细胞 ± s, n=8)

与IR组比较 1)P<0.05；与IPC组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

表2　各组大鼠心肌组织Bcl-2及Bax蛋白表达

图1　各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达

3讨论

当归有多种心血管药理作用，临床可用于缺血性心脏病的治疗，实验研究表明，当归注射液对大鼠IR损伤心肌细胞有重要的保护作用〔2〕。汤剂是临床中药应用的主要形式，而剂量是影响中药汤剂功效方向发挥的重要因素，在中国药典中当归汤剂的用量规定为6～12 g〔3〕，临床实践表明当归小剂量应用则补血，大剂量应用则活血〔4〕。而“活血”是当归防治缺血性心肌疾病的主要中药功效基础。大剂量当归水煎液口服给药防治缺血性心肌疾病则未见报道。

IPC对心肌具有强大的保护作用，但难以应用于临床，而药理预适应却能弥补这一缺陷，药理预适应是根据IPC机制，通过药物激发或模拟机体内内源性物质而呈现的保护心脏的作用。心肌缺血和再灌注过程中重要的病理变化就是心肌细胞死亡，其形式之一主要表现为细胞凋亡，而IPC可减少心肌细胞凋亡。研究证明心肌细胞凋亡在心肌IR中普遍存在，并起主导作用〔5〕。心肌细胞凋亡的发生是在多种凋亡基因的调控下进行的，其中 Bcl-2、Bax 相关凋亡基因被认为是最重要的细胞凋亡调控基因，在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用〔6〕。Bax作为Bcl-2的同源体，与Bcl-2一样在组织中广泛表达，其作用是抑制Bcl-2表达及活性〔7〕。本研究证实心肌IR可使心肌梗死面积及心肌细胞凋亡显著增加，IPC则可降低其梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，对心肌损伤起到了一定的保护作用。而在IPC的基础上，给予不同大剂量的当归水煎剂，均可进一步降低心肌梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，尤其以相当于人剂量的120 g的大剂量当归水煎液最为显著。其机制可能与上调Bcl-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达有关。

4参考文献

1陈彦文，明海霞，王强，等．岷县当归预适应对大鼠缺血-再灌注心律失常的影响〔J〕．西部中医药，2013;18(2)：15-7．

2优半,张端连．当归注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤后FAK表达的研究〔J〕．数理医药学杂志，2010; 23(1)：28-30．

3国家药典委员会．中国药典(一部)〔S〕.北京：中国医药科技出版社，2010：124-5.

4仝小林．重剂起沉疴〔M〕.北京：人民卫生出版社，2010：536．

5Machado NG，Alves MG，Carvalho RA，etal．Mitochondrial involvement in cardiac apoptosis during ischemia and reperfusion:can we close the box〔J〕．Cardiovasc Toxicol，2009;9(4)：211-27．

6荣晓凤,李荣亨,王维．气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞bcl-2及bax相关凋亡因子的表达〔J〕．中国老年学杂志,2010;30(5)：648-50．

7王卫东．Bcl-2/Bax比率与细胞“命运”〔J〕．中国肿瘤生物治疗学杂志，2007;14 (4)：393-6．

〔2013-12-06修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)