金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清及组织抗氧化活性的动态影响

金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清及组织抗氧化活性的动态影响

屈海琪杨国栋蒋伟袁丹华王书华安芳

(河北北方学院药学系，河北张家口075000)

摘要〔〕目的研究金莲花中荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)及组织细胞膜转运酶活性动态变化及比较荭草苷和牡荆苷药物抗氧化的构效关系。方法通过腹腔注射D-半乳糖，造成小鼠亚急性衰老，经过8 w造模并且验证模型成功后，随机分为正常组，模型组，维生素E对照组，荭草苷和牡荆苷低、中、高各三个剂量组，并从第9周开始各治疗组每日上午分别口服灌胃给药一次。给药2、4、6、8 w后，分别断头处死衰老小鼠，测定血清T-AOC及肾、肝、脑组织中细胞膜转运离子能力。结果荭草苷和牡荆苷具有提高衰老小鼠血清T-AOC及肾、肝、脑组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。与模型组相比，给药2、4 w后，各剂量组血清T-AOC及组织中ATP酶活性虽有提高，但无统计学意义(P>0.05)，给药6、8 w后，各剂量组血清T-AOC及组织中ATP酶活性显著提高(P均<0.01)；荭草苷与牡荆苷相比，给药2、4 w后，各剂量组在提高血清T-AOC及组织中ATP酶的活性无统计学意义(P>0.05)，给药6、8 w后，红草苷中、低剂量组在提高血清T-AOC及组织中ATP酶的活性上高于牡荆苷同等剂量组(P<0.05)，高剂量组相比无显著差异(P>0.05)；给药8 w后，荭草苷和牡荆苷中、低剂量组在提高血清T-AOC及组织中ATP酶的活性上低于VE(P<0.05)，而高剂量组与维生素E组相比无显著差异(P>0.05)。 结论荭草苷和牡荆苷给药6 w后，显著提高D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC活性，对D-半乳糖致衰老小鼠组织细胞膜转运能力的保护作用显著。其中，中、低剂量组荭草苷的抗氧化作用优于牡荆苷，荭草苷和牡荆苷的高剂量组与维生素E作用相当。

关键词〔〕荭草苷；牡荆苷；D-半乳糖；抗氧化

中图分类号〔〕R285〔

基金项目：张家口市科技局(11110015D)

通讯作者：安芳(1965-)，男，教授，硕士生导师，主要从事中药有效成分的提取及药理研究。

第一作者：屈海琪(1985-)，女，硕士，主要从事中药有效成分提取分离及药代学研究。

现代药理研究表明，金莲花中其主要活性成分是黄酮类化合物，具有抗病毒、抑菌、体外抑制多种肿瘤细胞株增殖的作用〔1～4〕。药动学研究指出，荭草苷和牡荆苷在动物体内吸收、分布、起效均较为迅速，组织分布中尤以肾脏浓度最高〔5，6〕。研究还证实了金莲花黄酮及单体荭草苷和牡荆苷良好的体内外抗氧化作用〔7，8〕，有关衰老动物体内抗氧化研究多仅限于一个时间点〔9，10〕，本实验观察给药2、4、6、8 w后各时间点荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)及组织中转运酶活性的影响，比较荭草苷和牡荆苷保护细胞膜转运能力作用的动态变化。

1材料与仪器

1.1试剂及药品D-半乳糖(分析纯)，上海试一化学试剂有限公司；牛血清蛋白(分析纯)，郑州益康有限公司；生理盐水，石家庄第四制药厂；T-AOC测试盒，南京建成生物有限公司(批号：20100610)；Na+-K+-ATP酶测试盒，南京建成生物有限公司(批号：20100920)；Ca2+-Mg2+-ATP酶测试盒，南京建成生物有限公司(批号：20100920)；考马斯亮蓝蛋白试剂盒，南京建成生物有限公司(批号：20100918)；N，N-二甲基甲酰胺，分析纯，上海试一化学试剂有限公司；吐温-80，分析纯，上海试一化学试剂有限公司。荭草苷和牡荆苷(自制，经1H-NMR和HPLC鉴定，纯度98.9%)。

1.2实验动物昆明种小鼠(河北北方学院动物中心提供，许可证号：SCXK京2004-0001)，于18～25 ℃室温下分笼饲养。

1.3动物分组健康的昆明种小鼠280只(雌雄各半)，随机分为正常组、模型组、荭草苷和牡荆苷低、中、高各三个剂量组、维生素E对照组，适应性饲养1 w后造模。

1.4造模方法采用D-半乳糖致亚急性衰老法〔11〕，在500 ml生理盐水中溶解10.0 g D-半乳糖，对小鼠进行腹腔注射，注射剂量为200 mg·kg-1·d-1，正常组以等体积生理盐水替代，造模8 w，每天给药剂量以小鼠体重变化来调整。

1.5给药方法荭草苷和牡荆苷溶液的配制：荭草苷和牡荆苷较难溶于水，经预试，N，N-二甲基甲酰胺:吐温-80：生理盐水=1∶1∶20为溶剂。从第9周始每日上午，各治疗组分别给予灌胃给药维生素E组给药剂量(20 mg/kg)，荭草苷、牡荆苷高中低三剂量组分别给药剂量是40、20、10 mg/kg，每天的给药剂量依据小鼠体重变化进行调整，模型组和正常组给等体积的溶剂。荭草苷和牡荆苷组给药时间设定2、4、6、8 w，维生素E组给药时间为8 w。

1.6血清T-AOC的测定机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲琳类物质形成稳定的络合物，通过比色，可测出其抗氧化能力的高低。给药2、4、6、8 w后，小鼠断头取血，以4 000 r/min离心10 min，取血清按照试剂盒上说明要求操作。T-AOC(U/ml)=〔(A测定管-A对照管)/0.3〕×(反应液总体积/取样的体积)×稀释前的倍数。

1.7组织Na+-K+-ATP和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性测定分别处死给药不同周期的小鼠后，准确称取小鼠肝、脑、肾组织重量，按10%重量体积比制成组织匀浆液，再取一定量的匀浆液加99倍的生理盐水制成0.1%的组织匀浆液0.1 ml，用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白。根据公式计算酶的活性。

1.8统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行LSD检验。

2结果

2.1荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC的影响荭草苷和牡荆苷具有提高D-半乳糖致衰老小鼠血清中T-AOC的能力，与正常组〔(16.70±3.82)U/ml〕相比，模型组中小鼠血清T-AOC明显低于正常组〔(8.91±1.13)U/L,P<0.01〕；与模型组相比，第2、4周荭草苷和牡荆苷各治疗组小鼠血清T-AOC活性有所提高，但无显著性差异；第6、8周，荭草苷和牡荆苷各治疗组使小鼠血清T-AOC活性明显提高(P<0.01)。给药8 w后，荭草苷和牡荆苷中、低剂量对提高小鼠血清T-AOC活性作用上弱于维生素E组(15.06±1.40，P<0.05)；荭草苷和牡荆苷高剂量组与维生素E组相比无显著差异(P>0.05)。荭草苷组与牡荆苷组相比，给药2、4 w后，各剂量组提高小鼠血清T-AOC活性无显著差异；给药6、8 w后，荭草苷中、低剂量组提高小鼠血清T-AOC活性高于牡荆苷同等剂量组(P<0.05)；高剂量组间无显著差异。见表1。

表1　荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠血清T-AOC的影响 ± s，U/ml)

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与维生素E组比较：3)P<0.05；与荭草苷中剂量组比较：4)P<0.05；与荭草苷低剂量组比较：5)P<0.05，表3、表4、表5同

2.2荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠体内组织细胞膜离子转运能力的影响与正常组相比，模型组小鼠组织内Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性明显降低(P<0.01)；与模型组相比，给药2、4 w后，荭草苷和牡荆苷各治疗组能够提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，但无显著差异(P>0.05)；给药6、8 w后，荭草苷和牡荆苷各治疗组明显提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性(P均<0.05)，说明小鼠衰老后细胞膜的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低，而各治疗组均具有升高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的作用。与维生素E组相比，给药8 w后，荭草苷和牡荆苷中、低剂量组在提高组织细胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性上作用较弱(P<0.05)；高剂量组与维生素E组相比无显著性差异(P>0.05)。荭草苷组和牡荆苷组相比，给药2、4 w后，各剂量组在提高组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性上无显著性差异(P>0.05)；给药6、8 w后，荭草苷中、低剂量组在对组织中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性影响上作用明显高于牡荆苷同等剂量组(P<0.05)；高剂量组之间相比无显著性差异(P>0.05)。见表2～表5。

表2　各组衰老小鼠不同组织Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性

与模型组比较:1)P<0.01

表3　荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠肾组织中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影响

表4　荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠肝组织中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影响

表5　荭草苷和牡荆苷对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织中Na +-K +-ATP酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP酶活性的影响

3讨论

人口老龄化使得与衰老相关因素的研究越来越受到人们的关注，至于衰老的机制目前还众说纷纭，其中自由基学说被广泛接受〔12〕。研究表明，由D-半乳糖诱导的衰老模型已逐渐用于老年病、衰老机制及抗衰老药物筛选等方面的研究〔13〕。

T-AOC在机体防御体系中占据着重要的作用，通过清除机体内浓度过高的活性氧自由基，预防自由基机制的失衡，从而使机体保持在相对稳定的状态，它可代表非酶促系统和抗氧化酶系统的变化〔14〕。老龄化过程中，病理生理尤为突出的一个重要环节是T-AOC水平的下降，也正是因此导致体内过多活性氧不能及时清除而造成积聚。这种机能的降低，常常导致疾病的发生和衰老的提前到来，因此体内的T-AOC水平的检测就显得尤为重要。本实验结果显示荭草苷、牡荆苷能够有效地提高机体内T-AOC的活性，荭草苷在提高机体内T-AOC的活性方面要优于牡荆苷，这可能与荭草苷和牡荆苷的结构差异有关， B环上具有邻二酚羟基的黄酮较B环上只连有单个酚羟基的黄酮氧化活性强。

Na+-K+-ATP酶活性与年龄的增加呈负相关，酶活性的降低使得细胞内ATP的生成减少，导致钠离子转运障碍，造成新陈代谢紊乱，从而使细胞的整体功能受到影响〔15〕。细胞内Ca2+的浓度大幅增加是ATP酶活性降低的另一结果，高水平的Ca2+将影响神经细胞的细胞骨架和膜结构，使稳定性降低，膜通透性增大，进而产生一系列恶性循环〔16〕。

本实验在动态的抗氧化研究中发现，给药周期为2～4 w时，荭草苷和牡荆苷还不能有效地发挥其抗氧化作用，当给药周期为6 w时，其抗氧化能力已经与给药8 w时无统计学差异，为今后抗衰老缩短给药时间，发挥良好药效，避免药物体内积累，安全用药提供了实验依据。且荭草苷对于提高组织细胞膜转运酶的活性高于牡荆苷，发挥抗氧化作用与维生素E相当。

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〔2013-07-04修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)