芦荟凝胶促进糖尿病创面溃疡愈合的机制

芦荟凝胶促进糖尿病创面溃疡愈合的机制

张扬朱平徐刚赖美铮熊晓清郭坚

(暨南大学医学院第四附属医院广州市红十字会医院内分泌科，广东广州510220)

摘要〔〕目的在分子水平探讨芦荟凝胶促进糖尿病创面溃疡愈合的机制。方法实验分为3组，A组为正常组，B组和C组应用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型并建立全皮伤口模型，B组给予生理盐水处理创面，C组给予芦荟凝胶干预，4次/d，通过胶原纤维-Masson三色法和免疫组织化学法评估伤口形成后3、7、14 d皮肤组织的组织病理学改变，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠皮肤基质金属蛋白酶(MMPs)-9和金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)-1 mRNA的表达情况。结果B组大鼠伤口愈合明显迟缓。芦荟凝胶干预可加速糖尿病大鼠大鼠伤口愈合。伤口愈合过程中，B组MMP-9 mRNA水平持续高于A组(P<0.01)，而TIMP-1 mRNA水平持续低高于A组(P<0.01)；给予芦荟凝胶干预的C组MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA水平仅在伤口形成第3天与A组相比具有统计学差异，其余时间点均与A组相近。芦荟凝胶干预可降低大鼠伤口组织MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值。结论糖尿病大鼠皮肤伤口愈合速度明显减慢，芦荟凝胶干预可加速糖尿病大鼠伤口愈合，芦荟凝胶的这种作用可能是通过调控MMP-9 /和TIMP-l水平实现的。

关键词〔〕芦荟凝胶；MMP-9；TIMP-1；糖尿病

中图分类号〔〕R587〔

基金项目：广东省建设中医药强省立项科研课题(20132008)；广东省临床用药研究基金(2013X05)

第一作者：张扬(1971-)，女，硕士，副主任医师，主要从事糖尿病及其慢性并发症的防治研究。

糖尿病创面难愈性病变是糖尿病的主要慢性并发症之一,也是糖尿病致残、致死的重要原因。据报道〔1〕每30秒全球就有1例糖尿病足溃疡导致截肢。因此，促进糖尿病创面溃疡的愈合具有重要临床意义。芦荟是一种集药食、保健、美容和观赏于一体的植物，用于治疗疮疡历史悠久，疗效确切，无明显不良反应，但其促进糖尿病创面愈合的作用机制尚未明确。本研究拟从基因水平探讨芦荟凝胶对糖尿病鼠皮肤创面愈合的干预作用及其可能的机制。

1材料与方法

1.1糖尿病大鼠模型的建立选用250 g左右SPF级雄性SD大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，随机分为3组，A组为正常组，B组和C组糖尿病组，每组再根据检测时间点随机分为0 d组、3 d组、7 d组、14 d组，每组7只。饲养1 w后，糖尿病组大鼠给予连续3 d的40 mg/kg链脲佐菌素腹腔内注射诱导糖尿病，正常组大鼠给予等量枸橼酸-枸橼酸钠液作为对照。3 d后于大鼠尾静脉采血检测随机血糖水平，并观察体重变化。若注射后随机血糖≥16.7 mmo/L则为糖尿病模型建立成功。所有大鼠实验期间均自由进食、饮水，每周监测体重和血糖。糖尿病组大鼠根据血糖水平给予1～3 U/d的鱼精蛋白锌胰岛素皮下注射，以维持血糖水平在16.7 mmo/L以上，并可降低酮症的发生，降低模型大鼠死亡率。

1.2皮肤伤口模型的建立〔2〕和取材糖尿病模型建成6 w后，腹腔注射水合氯醛300 mg/kg麻醉，减去大鼠背部毛，75%酒精消毒，用手术刀在大鼠背部正中距颅骨1 cm处制造一个1.3 cm×1.3 cm的正方形伤口，切除范围深达筋膜层。伤口愈合过程中如出现伤口局部皮肤红肿、渗液等细菌感染征象，则排除在研究之外。伤口形成后3 d、7 d和14 d，切除大鼠直至筋膜的整个伤口(包括伤口周围的5 mm内的正常皮肤)，标本的一半以4%发热多聚甲醛固定，用于HE、免疫组化和Masson染色，其余一半冻存于液氮中，用于后续的组织基质金属蛋白酶(MMP)-9和金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1 mRNA表达分析。

1.3芦荟凝胶的制作及治疗方法取中华芦荟鲜叶200 g，洗净，将芦荟表皮切除后于粉碎机中粉碎成浆状，用外用药膏盒分装封口，于2℃～4℃低温保存备用，每4 d制备1次。实验组给予芦荟凝胶外涂，4次/d。

1.4免疫组织化学和Masson染色CD68免疫组化染色评价巨噬细胞浸润情况， Masson染色法评价胶原纤维含量。免疫组化(S-P法)操作步骤参见说明书进行；Masson染色步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，滴加Masson复合染色液后蒸馏水冲掉染液，加入磷钼酸染色后滴加苯胺蓝蒸馏水稍冲，即滴加分化液分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封固。

1.5伤口愈合过程中组织学评分组织切片HE染色后，显微镜下观察以下指标：①表皮和真皮的再生情况；②新生肉芽组织厚度；③新生血管形成情况；④基质(胶原纤维)密度；⑤巨噬细胞浸润情况。评分标准参见文献报道〔3〕。

1.6RNA提取及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析上述标本使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1 ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。引物序列：MMP-9上游引物：5′-AGCCTGTGGTTGGTCAGAAG-3′，下游引物：5′-GTCCGGTTTCAGCATGTTTT-3′,TIMP-1上游引物：5′-GGTTCCCTGGCATAATCTGA-3′，下游引物：5′-GTCATCGAGACCCCAAGGTA-3′。

1.7统计学处理用SPSS16.0 软件行t或ANOVA检验。

2结果

2.1糖尿病大鼠模型建立及伤口愈合情况SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素3 d后，各时间点随机血糖均高于16.7 mmol/L， 糖尿病大鼠建模6 w末，与A组相比，B组和C组大鼠体重分别下降42%和43%〔A组：(201.46±18.89)g，B组：(198.91±18.42)g，C组：(345.55.46±34.48)g〕；伤口形成后第3天，A组伤口愈合率高于B组和C组(t=22.37，P<0.01；t=21.02，P<0.01)，伤口形成后第7天，A组伤口愈合率高于B组和C组(t=32.11，P<0.01；t=20.28，P<0.01)，而C组伤口愈合率高于B组(t=14.73，P<0.01)，伤口形成后第14天，A组和C组伤口愈合率均高于B组(t=12.47，P<0.01；t=9.97，P<0.01)，A组和C组间差异不具有统计学意义(t=1.96，P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠伤口愈合情况比较

与相应时间点B组相比：1)P<0.01；与相应时间点C组相比：2)P<0.01；下表同

2.2伤口组织学和病理生理学变化伤口形成后第3天，3组胶原得分差异无统计学意义，伤口形成后第7天，A组胶原得分高于B组和C组(t=25.35，P<0.01；t=21.45，P<0.01)，而C组胶原得分高于B组(t=13.29，P<0.01)，伤口形成后第14天，A组和C组胶原得分均高于B组(t=32.14，P<0.01；t=31.45，P<0.01)，A组和C组间差异不具有统计学意义(t=1.36，P>0.05)。伤口形成后第3天， 3组大鼠伤口周围纤维细胞和单核巨噬细胞浸润、伤口局部肉芽组织厚度、新生血管形成和再上皮化间差异不具有统计学意义；伤口形成后第7天，B组大鼠伤口周围纤维细胞和单核巨噬细胞浸润(t=38.22，P<0.01；t=26.36，P<0.01)、肉芽组织厚度(t=22.35，P<0.01；t=13.47，P<0.01)、新生血管形成(t=19.38，P<0.01；t=12.79，P<0.01)和再上皮化(t=25.89，P<0.01；t=19.96，P<0.01)均落后于A组和C组，而C组大鼠伤口周围纤维细胞和单核巨噬细胞浸润(t=24.32，P<0.01)、肉芽组织厚度(t=15.44，P<0.01)、新生血管形成(t=12.35，P<0.01)和再上皮化(t=20.11，P<0.01)仍落后于A组，至伤口形成后第14天，B组大鼠伤口周围纤维细胞和单核巨噬细胞浸润(t=40.11，P<0.01；t=38.69，P<0.01)、肉芽组织厚度(t=25.88，P<0.01；t=23.18，P<0.01)、新生血管形成(t=26.17，P<0.01；t=23.83，P<0.01)和再上皮化仍落后于A组和C组，而A组和C组间差异无统计学意义。见表2。

2.3MMP-9 和TIMP-1 mRNA水平的变化伤口形成第0天，各组MMP-9 和TIMP-1 mRNA均呈低水平的表达，B组和C组MMP-9 mRNA水平高于A组(t=38.36，P<0.01；t=36.46，P<0.01)，而TIMP-1 mRNA水平低于A组(t=37.46，P<0.01；t=36.26，P<0.01)；伤口形成后第3天，A组MMP-9 mRNA低于B组和C组(t=32.56，P<0.01；t=25.23，P<0.01)，而C组MMP-9 mRNA高于B组(t=11.25，P<0.01)，TIMP-1 mRNA水平变化与MMP-9 mRNA水平变化相反；伤口形成后第7、14天，A组和C组MMP-9 mRNA均低于B组(t=10.57，P<0.01；t=8.35，P<0.01)(t=19.46，P<0.01；t=17.97，P<0.01)，而TIMP-1 mRNA高于B组(t=22.35，P<0.01；t=19.45，P<0.01)(t=11.35，P<0.01；t=10.017，P<0.01)，A组和C组间差异无统计学意义(t=1.88，P>0.05)，(t=1.01，P>0.05)。见表3。

表2　各组大鼠伤口组织学和病理生理学变化 ± s, n=7)

表3　各组大鼠MMP-9 和TIMP-1 mRNA水平变化

2.4MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值变化伤口形成第0天，B组和C组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值显著高于A组(t=13.47，P<0.01；t=12.45，P<0.01)，伤口形成后第3天，A组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值低于B组和C组(t=36.35，P<0.01；t=15.35，P<0.01)，且A组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值低于C组(t=8.25，P<0.01)；伤口形成后第7、14天，A组和C组MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值低于均低于B组(t=40.57，P<0.01；t=38.56，P<0.01)(t=50.46，P<0.01；t=47.97，P<0.01)，A组和C组间差异不具有统计学意义(t=1.29，P>0.05；t=1.02，P>0.05)。见表4。

表4　各组大鼠MMP-9 mRNA/

3讨论

难愈创面主要与细菌负荷、生长因子减少、血流减少、蛋白酶水平升高和创面修复细胞的表型改变等多种因素有关〔4〕。伤口愈合是一个复杂且精细的过程，由多种细胞和分子参与，它们彼此之间相互协调共同完成伤口修复。正常的伤口愈合由凝血期、炎症期、增生期、修复期所组成，各个阶段之间没有明显的界限，它们连续发生并相互交错。其中，细胞移行、肉芽组织形成、新生血管化以及基质重塑等均与细胞外基质(ECM)有关〔5〕。MMPs和TIMPs是调节细胞外基质的重要成分，是胞外基质降解最主要的水解系统，在ECM合成和降解的代谢平衡中MMPs/TIMPs两个酶系统起着非常重要的作用。它们在胚胎形成、伤口愈合、肿瘤转移、类风湿关节炎等过程中MMPs/TIMPs均发挥重要作用〔6，7〕。

MMPs是一组锌依赖性肽链内切酶，能够降解ECM和非基质蛋白。现已发现的MMPs至少有16种，它们可以降解多种细胞外基质成分，包括胶原纤维、弹性纤维、纤维连接蛋白、层粘连蛋白。这些细胞外基质的降解则为其他细胞迁移至伤口处以及新生血管的穿入提供了空间，并且同时也刺激了新的细胞外基质的形成〔8〕。TIMPs由多基因家族成员组成，分为TIMP-1、2、3和4，主要由巨噬细胞和结缔组织细胞合成分泌，能与MMPs的催化区以1∶1可逆性结合，抑制MMPs的活性。TIMP-1主要与MMP-9和MMP-9酶原结合，同时也可与MMP-1、MMP-3结合形成1∶1化学复合物，因此局部创面过度表达具有生理活性的TIMP-1可能抑制创面组织中MMP-9活性。TIMP-1除了抑制MMPs的活性外，还具有调节细胞生长、抗凋亡和促迁移作用〔9〕，如(1)TIMP-1能促进角质形成细胞、成纤维细胞等有丝分裂作用；(2)抗凋亡作用，在体外能够通过激活PI3K/Akt通路抑制血管内皮细胞凋亡；(3)刺激角质形成细胞迁移作用。 我们已有的研究提示MMP-9/TIMP-1的表达失衡与创面难愈密切相关〔10〕。且文献报道，糖尿病大鼠皮肤在组织结构完整性未遭到破坏的情况下已存在组织学、细胞生物学行为及MMP-9/TIMP-1水平的改变〔11〕，本研究结果证实在伤口形成第0天，糖尿病组大鼠的MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值即著高于正常对照组。创面形成后，糖尿病组大鼠皮肤伤口愈合速度明显减慢，愈合过程中MMP-9 mRNA水平显著升高，TIMP-1mRNA水平相对减少，各个时间点糖尿病鼠伤口组织中MMP-9 mRNA /TIMP-1 mRNA比值明显增加。

中药外治法是临床治疗疮疡的一种常用方法，芦荟是其中的常用药物之一。芦荟味苦性寒，归肝、胃、大肠经，具清肝热、通便等功效，可用于通便、抗炎、调节免疫、抗菌、降低血糖、抗溃疡乃至抗肿瘤等〔12〕，已为许多国家的药典所收载。近年来，国内外逐步开展了一些关于芦荟抗糖尿病作用的实验研究。Rajasekaran等〔13〕用芦荟胶的乙醇提取物对正常空腹大鼠、口服葡萄糖的大鼠和STZ诱导的糖尿病大鼠的研究结果表明，芦荟提取物能通过对糖代谢酶的控制来维持葡萄糖的代谢平衡。Ngo等〔14〕报道了芦荟在治疗糖尿病大鼠伤口愈合方面的促进作用，大鼠背部的伤口通过芦荟胶局部敷药或口服等治疗方法，待伤口组织愈合后检测胶原质、氨基乙醣、伤口及皮肤的愈合速度等，结果表明芦荟可能通过影响炎症状态，纤维素增生、胶原质合成及伤口愈合过程等而起到治疗糖尿病伤口作用。本研究结果提示，芦荟凝胶可加速糖尿病大鼠大鼠伤口愈合；且在伤口愈合过程中，芦荟凝胶干预可降低大鼠伤口组织MMP-9/TIMP-1 mRNA比值。综上，芦荟凝胶具有加速糖尿病大鼠伤口愈合的作用，而这种作用可能是通过调控MMP-9 /和TIMP-1水平实现的。

4参考文献

1Tomesova J,Lacigova S,Cechurova D,etal.Unusual cause of foot defect in patient with diabetes mellitus〔J〕. Vnitr Lek,2012;58(11):875-7.

2王春田,王莉,石岩.2型糖尿病动物模型制备方法探讨〔J〕. 实用中医内科杂志,2011;25(4):27-30.

3Galeano M，Altavilla D，Cucinotta D，etal．Recombinant human erythropoietin stimulates angiogenesis and wound healing in the genetically diabetic mouse〔J〕．Diabetes，2004;53(9):2509-17．

4Cowman S,Gethin G,Clarke E,etal.An international eDelphi study identifying the research and education priorities in wound management and tissue repair〔J〕. J Clin Nurs,2012;21(3-4):344-53.

5Choi JS,Kim JD,Yoon HS,etal.Full-thickness skin wound healing using human placenta-derived extracellular matrix containing bioactive molecules.〔J〕. Tissue Eng Part A,2013;19(3-4):329-39.

6Estella C,Herrer I,Atkinson SP,etal.Inhibition of histone deacetylase activity in human endometrial stromal cells promotes extracellular matrix remodelling and limits embryo invasion.〔J〕. PLoS One,2012;7(1):e30508.

7Wang JG,Ruan J,Li CY,etal.Connective tissue growth factor,a regulator related with 10-hydroxy-2-decenoic acid down-regulate MMPs in rheumatoid arthritis.〔J〕. Rheumatol Int,2012;32(9):2791-9.

8Luizon MR,Amaral LM,Palei AC.Matrix metalloproteinases(MMPs) and tissue inhibitors of MMPs genetic polymorphisms and plasma levels in hypertensive disorders of pregnancy〔J〕. J Hum Hypertens,2012;24(7):938-45.

9Pitiyage GN,Lim KP,Gemenitzidis E,etal.Increased secretion of tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2(TIMPs -1 and -2) in fibroblasts are early indicators of oral sub-mucous fibrosis and ageing〔J〕. J Oral Pathol Med,2012;41(6):454-62.

10朱平,严励.基因治疗与皮肤创面愈合〔J〕. 国际外科学杂志,2009;29(2):281-4.

11严励,朱平,陈黎红,等.MMP-9/TIMP-1表达失衡与糖尿病大鼠皮肤"隐性损害"关系的初步探讨〔J〕. 中华内分泌代谢杂志,2008;24(5):533-6.

12孙培.芦荟的药理作用研究进展〔J〕. 湖北中医杂志,2012;34(4):79-80.

13Rajasekaran S,Sriram N,Arulselvan P,etal.Effect of aloe vera leaf gel extract on membrane bound phosphatases and lysosomal hydrolases in rats with streptozotocin diabetes.〔J〕. Pharmazie,2007;62(3):221-5.

14Ngo MQ,Nguyen NN,Shah SA.Oral aloe vera for treatment of diabetes mellitus and dyslipidemia〔J〕. Am J Health Syst Pharm,2010;67(21):1804,1806,1808.

〔2013-06-15修回〕

(编辑徐杰)