软骨藻酸作用蛋白质的亲和毛细管电泳筛选

王晓倩， 高 铁， 洪 专， 屈 锋*

（1. 北京理工大学生命学院，北京100081；2. 国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建 厦门361000）

贝类毒素是有毒有害赤潮生物产生的生物活性物质的总称。软骨藻酸（domoic acid，DA）是贝类毒素的一种，它溶于水且具有强烈的神经毒性，是与红藻酸（2-羧基-3-异丙烯基脯氨酸）相关的非蛋白氨基酸类活性物质［1］。其分子结构见图1。

图1 软骨藻酸的化学结构式Fig.1 Chemical structure of domoic acid

水中的贝类和鱼类对DA 有较强的耐受力，可以富集藻类产生的DA，再经食物链进行传递。人类食用被DA 污染的海产品后即可引起中毒。因此，DA 的毒理作用及检测对于海洋生物学和海洋食品安全研究十分必要。目前DA 的研究多见于定量分析检测，如酶联免疫法［2］、胶体金免疫层析法［3］、高效液相色谱法［4，5］以及毛细管区带电泳法［6-9］。DA 与谷氨酸受体作用使细胞内Ca2＋蓄积超载并进入线粒体，抑制氧化磷酸化，造成ATP 合成不足，导致细胞损伤和坏死［10，11］。DA 可影响某些神经损伤与修复相关基因的表达及蛋白质的上调与下调，如增强WDR35 蛋白质的表达，也可直接导致DNA 损伤［12-15］。上述毒理学研究大多采用动物或细胞实验，检测与DA 毒性作用相关的蛋白质。由此可见，研究DA 与重要功能蛋白质的相互作用有助于了解DA 对生物大分子的毒性机制分析。建立可与DA 作用的功能蛋白质的快速筛选方法，有助于理解DA 的毒性机理，为DA 的解毒作用和DA毒性的防护提供基础信息。

目前DA 与其他重要功能蛋白质作用的研究鲜见报道。本文选择血浆、肠道及细胞线粒体中9 种重要的功能蛋白质，基于亲和毛细管电泳，定性比较了这些蛋白质与DA 的相互作用强弱。目的是将亲和毛细管电泳用于DA 作用靶蛋白的快速筛选，拓展毛细管电泳在DA 受体蛋白筛选中的应用，也为其他受体蛋白的筛选提供高效，快速，低成本的方法。目前关于DA 与上述功能蛋白质作用评价的研究尚未见报道。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Agilent 7100 毛细管电泳仪，配备二极管阵列（DAD）检测器（美国Agilent 公司）。

软骨藻酸（DA）由国家海洋局海洋生物资源综合利用工程技术研究中心提供；人凝血酶（H-Thr）购自Enzo Life Sciences 公司；细胞色素C（Cyt C）、胰蛋白酶（Try）、免疫球蛋白E （Ig E）、核糖核酸酶A（RNase A）、λ 核酸外切酶（λExo）、转铁蛋白（Trf）、铁蛋白（Fer）、凝集素（Lec）均购自Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO，纯度＞99.5%）购自北京拜尔迪公司。

氢氧化钠、硼砂和硼酸（分析纯），购自北京化工厂；实验室用水为蒸馏水。

熔融石英毛细管购自邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司。

1.2 溶液的配制

将50 mmol／L Na2B4O7溶液和200 mmol／L H3BO3溶液以6 ∶4 的体积比混合，配制200 mmol／L（pH 8.7）硼酸盐储备液，并稀释为50 mmol／L（pH 8.7）硼酸盐溶液作为电泳缓冲液，经0.22 μm 滤膜过滤后使用。

精确称量软骨藻酸纯品0.001 0 g，加水1 mL溶解，摇匀，作为储备液，质量浓度为1 mg／mL，-20℃保存。

1.3 毛细管电泳实验条件

熔融石英毛细管（有效长度／总长：40 cm／48.5 cm，内径75 μm）；进样压力：5 kPa；进样时间：5 s；分离电压：＋20 kV；分离温度：25 ℃；检测波长：214 nm（亲和毛细管电泳），242 nm（毛细管区带电泳）。

新毛细管在使用前分别用1 mol／L NaOH、0.1 mol／L NaOH、H2O 各冲洗30 min。两次实验进样间用0.1 mol／L NaOH、H2O 和缓冲液各冲洗3 min。毛细管不用时两端水封，于室温下保存。

2 结果与讨论

2.1 蛋白质的特性及生理功能

本文选用9 种重要的功能蛋白质作为DA 作用的靶标，其中人凝血酶、lgE、转铁蛋白、铁蛋白和凝集素为血浆蛋白；核糖核酸酶A 和λ 核酸外切酶为核酸酶；还有位于肠道中的胰蛋白酶及与生物氧化相关的细胞色素C。

2.2 亲和毛细管电泳分析法

亲和毛细管电泳通常可用于亲和配体和受体间结合常数的计算。将不同浓度的配体加入背景电泳溶液中，受体因与溶液中的配体发生亲和作用导致受体的迁移时间随配体浓度的增加而发生改变，即淌度迁移法。具体公式如下［16］：

ML：溶液中蛋白质配体浓度为L 时受体与电渗流的淌度比；μi：受体的有效淌度；μapp：表观淌度；μeof：电渗流淌度；teof：电渗流迁移时间；ti：受体迁移时间；M0：溶液无蛋白质配体时的淌度比；ΔM：淌度比的差值；ΔMmax：形成复合物达到饱和时淌度比的变化量；Kb：结合常数。以1／ΔM 与1／L 作线性图，Kb为截距与斜率之比。

淌度迁移法一般可用于亲和力较强时受体配体相互作用的结合常数计算。但实验中，当亲和作用较弱时，结合常数为负值，故不能直接计算结合常数。因此，亲和作用弱时，可通过淌度比的变化量ΔM 随蛋白质配体浓度L 的变化来定性比较亲和作用［17］。当配体浓度L 增加时，ΔM 的增量越大，则受体与配体的相互作用越强。以ΔM 与L 作线性图，斜率越大，表明相互作用越强。本实验中，以中性二甲基亚砜（DMSO）为电渗流标记物，将0、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol／L 的9 种配体蛋白质（H-Thr、Ig E、Try、Cyt C、RNase A、λExo、Trf、Fer、Lec）分别加入电泳缓冲液，检测0.2 mg／mL DA 随蛋白质浓度增加的迁移时间改变。

2.3 DA 与蛋白质作用的比较

2.3.1 与DA 作用的蛋白质

图2 和图3 为亲和毛细管电泳图。图2 电泳图中DA 峰随蛋白质浓度增加，其迁移时间明显延长。由于蛋白质浓度增大，同时导致溶液黏度增大，通过电渗流变化进行校正，DA 相对DMSO 的迁移时间也增加。且6 种蛋白质加入溶液时，DA 峰随蛋白质浓度增加变矮展宽（见图2），表明DA 和6 种蛋白质之间存在相互作用。其中，以图2 H-Thr 谱图中峰迁移最明显，H-Thr 的浓度达0.6 μmol／L 时，30 min 已不能检测到DA 的峰。相比之下，λExo的峰迁移最小，相互作用最弱。

图2 DA 与6 种蛋白质的亲和毛细管电泳图Fig.2 Affinity capillary electropherograms of domoic acid （DA）and six proteins

2.3.2 不与DA 作用的蛋白质

Trf、Fer 和Lec 作为配体时，蛋白质浓度增加并未引起DA 迁移时间的趋势性增加，DA 也无明显的峰展宽（见图3），说明Trf、Fer 和Lec 与DA 无明显相互作用。

图3 DA 与3 种蛋白质的亲和毛细管电泳图Fig.3 Affinity capillary electropherograms of domoic acid and three proteins

2.3.3 相互作用的定性比较

进一步比较淌度比变化量ΔM 与9 种蛋白质浓度L 的线性图斜率，可知蛋白质与DA 的相互作用强弱为：H-Thr ＞Cyt C ≈Try ≈Ig E ≈RNase A ＞λExo （见图4a）。而Fer、Trf、Lec 未能表现出一定的亲和力（见图4b）。此处，亲和电泳图的直观比较与淌度比变化量ΔM-蛋白质浓度L 线性关系的斜率值判断结果一致。

根据以上结果初步推断，人体摄入DA 后，DA有可能与胰蛋白酶结合，减少DA 吸收入血。入血的DA 又可与凝血酶较强结合，从而影响正常的凝血功能。DA 还有可能在一定程度上减轻或抑制由血清Ig E 含量过高而引起I 型过敏反应。此外，DA与核酸酶RNase A，λExo 也存在一定的亲和作用，可能引起DNA 的损伤。细胞色素C 存在于线粒体中，DA 不易进入线粒体，但DA 毒性可导致线粒体功能紊乱，诱发细胞色素C 释放到细胞质，诱导细胞凋亡［11］。因此，体内DA 能否与细胞色素C 发生作用，作用后是否产生生理影响等尚不得而知，需要进一步探讨。

图4 淌度比的变化量（ΔM）与蛋白质配体浓度（L）的关系Fig.4 Relationships between variation of mobility ratio （ΔM）and protein ligand concentration （L）

目前尚未见到DA 的亲和毛细管电泳研究报道。为了验证所建立的亲和毛细管电泳方法可靠，在1.3 节所述实验条件下，进行了DA 的毛细管区带电泳分析，并将此实验结果与李大志等［8］采用BioFocus 3000 全自动毛细管电泳仪的DA 检测结果对比。由表1 可知，本文的DA 检测结果与文献［8］基本吻合，且DA 峰的迁移时间和峰面积的精密度和重现性更优。因此，利用亲和毛细管电泳法，根据DA 迁移时间变化来定性分析9 种蛋白质与DA 的亲和作用可行。

表1 软骨藻酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、精密度及重现性Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients （R2），limits of detection （LODs），precisions and repeatabilities of domoic acid

3 结论

基于亲和毛细管电泳法，将蛋白质作为配体加入电泳缓冲液，通过DA 在电泳图中的淌度迁移可直观判断蛋白质与DA 的相互作用强弱。通过DA淌度比与蛋白质浓度线性关系可定性比较相互作用强弱。由于DA 具有强烈的神经毒性，对于可与DA作用的多种蛋白质的筛选，亲和电泳毛细管无疑是一种高效、快速、所需DA 样品量极低的筛选方法。方法具有一定的普适性。

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