植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的影响

谢俊华，聂少平，丁 翘，余 强，胡婕伦，熊 涛，谢明勇

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的影响

谢俊华，聂少平*，丁 翘，余 强，胡婕伦，熊 涛，谢明勇

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

目的：探讨植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的影响。方法：利用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，将小鼠随机分为5 组，即正常对照组、模型组、胡萝卜原浆组、发酵胡萝卜浆组、灭活发酵胡萝卜浆组。小鼠以灌胃的方式给予胡萝卜原浆、发酵胡萝卜浆和灭活发酵胡萝卜浆后，分别测定各组小鼠胸腺指数和脾脏指数，酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法测定小肠组织白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-10和分泌型免疫球蛋白A（secretory immunglobulin A，sIgA）含量，小肠组织病理学观察及直接免疫荧光检测IgA分泌B细胞数。结果：实验组与模型组相比，植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆能显著提高小鼠胸腺和脾脏指数，增加IgA分泌B细胞数量，提高细胞因子IL-2和sIgA的水平，改善肠道形态结构，但TNF-α和IL-10含量没有显著增加。结论：植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆能有效拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用和肠道结构损伤作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能和改善肠道形态结构。

植物乳杆菌NCU116；发酵胡萝卜浆；肠道黏膜免疫

肠道不仅是消化吸收的重要场所，也是机体最大的免疫器官，肠道黏膜表面积庞大，它的结构和功能构成强大的黏膜免疫系统[1]。乳酸菌作为机体肠道中重要的生理菌群，在预防和治疗急性胃肠炎、缓解过敏、抑制肠道炎症反应等免疫调节方面有重要作用[2]。但是由于不同乳酸菌细胞壁的蛋白表达谱和DNA未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤（cytidine-phosphatte-guanine，CpG）二核苷酸含量存在差异，因此不同益生菌对机体的免疫调节作用存在特异性[3]。乳酸菌可以通过调节相关免疫细胞的增殖分化、表面分子的表达以及细胞因子的分泌等作用增强机体免疫能力，如增强肠道巨噬细胞的吞噬能力[4]、增加肠道树突状细胞（dendritic cells，DCs）及巨噬细胞表达CD80、CD86、MHCⅡ分子[5]、增加小肠固有层IgA分泌B细胞数量[6]、增加肠道中抗炎性因子白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的分泌量[7]。

IL-2、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是主要由机体活化T细胞分泌的促炎细胞因子[8]；IL-10是重要的抗炎因子，能抑制辅助性T细胞、自然杀伤性细胞（natural killer cells，NKs）和巨噬细胞的活性[9]。分别调节机体细胞免疫和体液免疫水平，两者的平衡和适度的分泌水平在维持机体正常免疫功能方面有重要作用[10]。乳酸菌通过识别肠道上皮细胞及相关免疫细胞如DCs的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），由促分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）等通路将信号级连放大并传递给下游相关免疫细胞如T细胞、巨噬细胞等，介导免疫细胞增殖和分化并分泌相关细胞因子、趋化因子和其他效应因子[11]，如促进IgA分泌B细胞的增殖和分化，提高肠道黏膜分泌型免疫球蛋白A（secretory immunglobulin A，sIgA）分泌水平。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NCU116是由本课题组从泡菜老液中分离得到的一株益生菌[12]。研究表明，它具有较好的培养特性[13-16]，能有效改善机体的一些疾病，如非酒精性脂肪肝[17]、高血脂[18]、2型糖尿病[19]。胡萝卜是常食用的蔬菜之一，富含功能性成分维生素和矿物质，尤其含有大量类胡萝卜素，研究表明摄入一定量的类胡萝卜素能提高机体免疫功能和抑制肿瘤生长[20-21]，并且经益生菌发酵的果蔬产品能增加它的营养和益生作用[19]。但目前还没有研究报道植物乳杆菌NCU116发酵产品对肠道黏膜免疫的影响，为此本实验采用化疗药环磷酰胺诱导建立小鼠免疫抑制模型，探讨植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对小鼠肠道黏膜免疫的影响，以期为植物乳杆菌NCU116在果蔬发酵产品中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌NCU116菌粉发酵胡萝卜浆产品由本课题组提供。

清洁级BALB/c小鼠40 只，雌性，6～8 周龄，体质量（20±2） g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004。

环磷酰胺（批号：07112221） 江苏恒瑞医药股份有限公司；小鼠TNF-α、IL-2、IL-10酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司；小鼠sIgA ELISA试剂盒 武汉优尔生科技股份有限公司；IgA-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记抗体 英国Abcam公司；柠檬酸钠修复液、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）复染液、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色液 上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；E-330酶标仪 美国Thermo公司；生物显微镜、倒置显微镜 日本Olympus公司；SHP-150型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；自动组织脱水机、生物组织包埋机、电脑生物组织摊烤片机、轮转式切片机 浙江省金华市科迪仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

当地市售新鲜胡萝卜经过如下加工流程[22]制得未发酵胡萝卜原浆（A）、发酵胡萝卜浆（B）和灭菌胡萝卜浆（C）。

为保证发酵胡萝卜浆中活菌含量，在实验之前，对其活菌数进行测定。用MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培养基梯度稀释发酵胡萝卜浆样品至合适浓度，37 ℃培养48 h后对菌落进行计数。结果显示发酵胡萝卜浆活菌含量为109CFU/g。

1.3.2 动物分组与处理

将小鼠适应饲养一周后，随机分为5 组，每组8 只，分别为正常对照组（A组）、模型组（B组）、胡萝卜原浆组（C组）、发酵胡萝卜浆组（D组）、灭活发酵胡萝卜浆组（E组）。除正常对照组外，各组小鼠连续3 d腹腔注射环磷酰胺80 mg/（kg·d）建立免疫抑制小鼠模型，造模结束后随机选取正常对照组和模型组各2 只小鼠，测定免疫器官指数和血清中IL-2含量，结果显示模型组小鼠器官指数和血清中IL-2含量明显低于正常对照组，说明免疫抑制小鼠模型建立成功。然后实验组分别灌胃10 mL/（kg·d）胡萝卜原浆、发酵胡萝卜浆和灭活发酵胡萝卜浆，正常对照组、模型组给予等体积的生理盐水，每天上午9点灌胃一次，连续灌胃21 d。饲养环境温度（22±1）℃，相对湿度（50±10）%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由饮食、饮水。

1.3.3 计算小鼠胸腺和脾脏指数

末次给药24 h后，称体质量，颈椎脱臼处死小鼠，立即分离出胸腺和脾脏。以胸腺或脾脏质量和体质量的比值表示胸腺和脾脏指数（mg/g）。

1.3.4 小肠组织细胞因子含量的检测

取约100 mg空肠组织用冷生理盐水制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，收集上清液，分别按照IL-2、IL-10、TNF-α和sIgA ELISA试剂盒操作说明，测定相应细胞因子的含量。

1.3.5 小肠组织病理学观察

取适量空肠组织，参照Chen Changying等[23]的方法进行HE染色，100 倍光学显微镜下详细观察和比较空肠黏膜形态结构的变化，并应用图像分析系统（Image-Pro Plus 6.0），具体测量肠绒毛长度和隐窝深度。每段空肠取3 张切片进行拍照，每张切片随机选取2 个视野对5 根最长肠绒毛的长度（以肠腺绒毛连接处到绒毛顶端为准）和最深隐窝深度（以肠腺绒毛连接处到肠腺基部为准）进行测量，并取平均值。

1.3.6 小肠组织直接免疫荧光法检测IgA分泌B细胞

直接免疫荧光法检测IgA分泌B细胞参照de Moreno等[24]的方法，每段空肠取1 张切片进行200 倍荧光显微镜视野下观察拍照，每张切片随机选取2 个视野运用Image-Pro Plus 6.0计数IgA分泌B细胞数，并取平均值。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响

免疫系统是生物必备的防御机构，由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。胸腺、脾脏组织是机体的主要免疫器官，胸腺、脾脏指数的高低客观地反映机体非特异性免疫能力强弱[25]。由表1可知，环磷酰胺造模后，模型组小鼠的胸腺指数和脾脏指数显著低于正常对照组（P＜0.05），说明小鼠免疫抑制模型造模成功。与模型组胸腺指数和脾脏指数比较，胡萝卜原浆组、发酵胡萝卜浆组、灭活发酵胡萝卜浆组胸腺指数和脾脏指数都显著增加（P＜0.05）。与正常对照组相比，胡萝卜原浆组胸腺指数显著降低（P＜0.05），而脾脏指数没有显著性差异；发酵胡萝卜浆组的胸腺指数和脾脏指数和灭活发酵胡萝卜浆组的脾脏指数都明显高于正常对照组（P＜0.05）。

表1 各组小鼠胸腺指数、脾脏指数测定结果Table 1 Thymus and spleen indices in immunosuppressed mice

2.2 植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠细胞因子水平的影响

表2 各组小鼠小肠组织细胞因子含量Table 2 Contents of cytokines in the small intestine of immunosuppressed mice

取空肠组织匀浆上清，适当梯度稀释，采用ELISA法测定IL-2、IL-10、TNF-α和sIgA含量，结果如表2所示。IL-2、TNF-α和IL-10是3 个重要介导免疫反应的细胞因子，sIgA是介导体液免疫的一个重要抗体。由表2可知，模型组与正常对照组相比，小鼠空肠组织IL-2、TNF-α、IL-10和sIgA分泌水平都显著降低（P＜0.05）。发酵胡萝卜浆组sIgA含量较模型组显著增加（P＜0.05），但是IL-2、TNF-α和IL-10含量与模型组相比并无显著性差异。灭活发酵胡萝卜浆组IL-2含量与模型组相比显著增加（P＜0.05），灭活发酵胡萝卜浆组sIgA含量与模型组相比显著增加（P＜0.05），而TNF-α含量与模型组相比显著降低（P＜0.05），IL-10含量与模型组相比无显著性差异。胡萝卜原浆组发酵IL-2和TNF-α含量与模型组相比无统计学差异，sIgA含量显著高于模型组（P＜0.05），而IL-10含量显著低于模型组（P＜0.05），其分泌水平低于发酵胡萝卜浆组和灭活发酵胡萝卜浆组。

2.3 小肠组织病理学观察

图1 各组小鼠空肠组织病理学观察（HE，×100）Fig.1 Histopathological observations of the jejunum from different groups (HE, × 100）

小肠组织病理学观察如图1所示，正常对照组（图1A）小肠绒毛排列整齐、较深隐窝、肠壁厚实明确的刷状缘，而模型组（图1B）绒毛长度明显下降、隐窝变浅或无、肠壁变薄、轻微水肿并且部分细胞有炎性浸润。免疫抑制小鼠在给予植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆（图1D）和灭活发酵胡萝卜浆（图1E）后肠道相关结构形态得到不同程度的改善。而胡萝卜原浆组（图1C）小鼠空肠组织结构改善作用相比发酵胡萝卜浆组和灭活发酵胡萝卜浆组不明显。

图2 各组小鼠空肠组织绒毛长度和隐窝深度（HE，×100）Fig.2 Villus length and crypt depth in the jejunum from different groups (HE, × 100)

如图2所示，模型组空肠绒毛长度和隐窝深度较正常对照组都显著降低（P＜0.05）。免疫抑制小鼠在给予植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆和灭活发酵胡萝卜浆后空肠绒毛长度和隐窝深度显著增加（P＜0.05），部分已经恢复到正常对照组小鼠的状态。而胡萝卜原浆组小鼠空肠组织结构没有得到显著的改善，隐窝深度还有降低的趋势。

2.4 植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠IgA分泌B细胞数量的影响

图3 直接免疫荧光法检测各组小鼠空肠IgA分泌B细胞（IF，×200）Fig.3 Immunofluorescence assay for IgA-secreting B cells in the jejunum of mice (IF, × 200)

每段空肠取3 张切片进行直接免疫荧光法检测IgA分泌B细胞，DAPI复染核和IgA-FITC标记抗体如图3所示，每张切片随机选取2 个视野运用Image-Pro Plus 6.0计数IgA分泌B细胞数，并取平均值如图4所示。

图4 实验各组小鼠空肠IgA分泌B细胞数量（IF，×200）Fig.4 IgA-secreting B cells in the jejunum of mice (IF, × 200)

IgA分泌B细胞是分泌sIgA抗体的重要免疫细胞。如图4所示，模型组的IgA分泌B细胞数量显著低于正常对照组（P＜0.05），在给予植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆后，发酵胡萝卜浆组、灭活发酵胡萝卜浆组分别较模型组的IgA分泌B细胞数量显著性增加（P＜0.05）。胡萝卜原浆组IgA分泌B细胞数量与模型组无显著差异，并且显著低于正常对照组水平（P＜0.05）。

3 讨 论

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，发育情况的好坏决定机体免疫力的强弱。石峰等[26]用添加0.3%乳酸菌微生态制剂饲喂AA肉鸡，结果显示，添加0.3%乳酸菌微生态制剂组与对照组比较，脾脏和胸腺指数分别提高了44.26%、13.51%。可能是由于乳酸菌在肠道内大量繁殖并合成了许多有益物质如维生素和氨基酸等，为免疫器官的发育提供了营养物质，另外，也可能是乳酸菌作为抗原物质刺激了免疫器官的生长发育。实验结果表明，发酵胡萝卜浆组和灭活发酵胡萝卜浆组的胸腺指数和脾脏指数都不同程度的高于模型组；并且显著高于正常对照组，推断可能由于给予小鼠发酵胡萝卜浆剂量太大，超过小鼠的免疫耐受范围，引起过度的免疫反应。表明摄入适量的植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆可以促进机体免疫器官的生长发育，从而可以增强动物体的免疫机能。

肠道是机体最大的免疫器官，其中肠相关淋巴组织（gut associated lymphoid tissues，GALT）是发挥免疫功能的主要部分，主要作用是防止病原体通过黏膜免疫系统侵害机体[27]。GALT由派伊尔结、肠系膜淋巴结、固有层和肠上皮中的大量淋巴细胞组成。而固有层中的B细胞被激活后，可分化成IgA分泌B细胞。de Merono等[28]研究也表明，长期摄入益生菌发酵乳能增加肠道相关免疫因子分泌细胞如IgA分泌B细胞的数量显著增加。有研究表明乳酸菌可通过肠道黏膜DCs，刺激B细胞迁移，进而促进IgA分泌B细胞分化[29]。实验结果表明在给予植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆后能刺激肠道IgA分泌B细胞的增殖。

IL-2、TNF-α和IL-10是3 个重要的细胞因子，IL-2主要由活化的T淋巴细胞分泌并参与淋巴细胞的增殖、成熟和分化，在调节黏膜免疫中有重要作用[30]；TNF-α主要由单核细胞/巨噬细胞和T淋巴细胞产生，并且参与调节炎症反应和细胞免疫反应包括吞噬作用[31]；IL-10是调节机体免疫反应水平的重要细胞因子，能抑制辅助型T细胞、NK细胞和巨噬细胞的活性，防止机体过度免疫反应[9]。免疫球蛋白是机体分泌能与抗原发生反应的一类蛋白质，其含量的高低决定着机体免疫力的强弱[32]，sIgA是肠道黏膜免疫中重要的应答抗体，分泌至肠腔可以通过免疫排斥作用防止病原菌在肠上皮细胞的黏附[33]。研究表明IL-5能刺激B细胞的增殖与分化，促进活化的B细胞分化成IgA分泌B细胞，而IL-2能够增强IL-5的作用，促进sIgA的生成[34]。朱于敏等[35]给小鼠灌服酸奶，然后测定其血清中的IL-2的含量，发现IL-2含量显著升高，表明乳酸菌对IL-2具有正调节作用。实验结果表明，发酵胡萝卜浆组和灭活发酵胡萝卜浆组小鼠的IL-2、sIgA含量和IgA分泌B细胞数均显著高于模型组，说明植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对IL-2具有正调节作用，进而可能促进sIgA的分泌。TNF-α和IL-10是两种重要的细胞因子，实验结果表明，植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对TNF-α和IL-10含量没有显著影响，这有可能跟植物乳杆菌NCU116本身的免疫调节机制有关，有报道称不同乳酸菌介导TNF-α和IL-10分泌的能力不同[2]，甚至有下调的作用[28]。

小肠的正常组织结构是营养物质被充分消化吸收的保障，小肠绒毛的长度和数量与肠道生理功能密切相关[36]。小肠绒毛变长、数量增加，进而增加小肠黏膜面积，有利于微生物的定殖和对营养物质的利用，从而促进小肠消化和吸收。微生物及其代谢产物能够引起肠壁的厚度增加，使更多的固有膜延伸到肠绒毛中央。Maldonado等[37]研究表明益生菌发酵乳能改善肠道组织的形态结构；易阳等[38]研究报道肉鸭摄入合生素（益生菌与益生元结合使用的生物制剂）可显著增加十二指肠绒毛长度（P＜0.05）。本实验结果表明，免疫抑制小鼠在给予植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆后小肠绒毛和隐窝深度显著增加，肠道形态结构也得到明显改善。

综上所述，植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆和灭活发酵胡萝卜浆不仅能改善环磷酰胺对肠道结构的损伤，还能通过增加免疫器官指数，增加免疫细胞的增殖和分化，促进细胞因子分泌，从而发挥对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。上述结果及分析推断发酵胡萝卜浆的免疫调节作用优于灭活发酵胡萝卜浆。本实验结果可为更充分利用乳酸菌、开发出更多功能的乳酸菌制品提供理论依据与实践指导。

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Effect of Carrot Slurry Fermented with Lactobacillus plantarum NCU116 on Intestinal Mucosal Immunity in Immunosuppressed Mice

XIE Junhua, NIE Shaoping*, DING Qiao, YU Qiang, HU Jielun, XIONG Tao, XIE Mingyong
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To study the effect of carrot slurry fermented with Lactobacillus plantarum NCU116 on intestinal mucosal immunity in immunosuppressed mice. Methods: Immunosuppressed mouse model was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamid. Forty mice were randomly divided into 5 groups: blank control group, model control group, carrot slurry group, fermented carrot slurry group and sterilized fermented carrot slurry group. The mice were administered with slurry fermented with Lactobacillus plantarum NCU116 and sterilized fermented carrot slurry at a dose of 10 mL/(kg·d) for 21 consecutive days. At 24 h after the last administration, the mice in each group were sacrificed. Thymus and spleen indices were determined, the contents of IL-2, TNF-α, IL-10 and sIgA in small intestine were determined by using quantitative sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits, small intestine morphology was observed by hematoxylin-eosin (HE) stained section and immunofluorescence was used to assay IgA-secreting B cells. Results: Compared to the model control, carrot slurry fermented with Lactobacillus plantarum NCU116 could significantly increase thymus and spleen indices and the number of IgA-secreting B cells, enhance IL-2 and sIgA levels and improve the intestinal morphological structure. But the concentrations of TNF-α and IL-10 were not significantly increased. Conclusion: Carrot slurry fermented with Lactobacillus plantarum NCU116 can effectively antagonize cyclophosphamide-induced immune suppression and ameliorate intestinal morphological damage in mice, enhance immune function and improve intestinal morphology in immunosuppressed mice.

Lactobacillus plantarum NCU116; fermented carrot slurry; intestinal mucosal immunity

TS201.3

A

1002-6630（2015）21-0201-06

10.7506/spkx1002-6630-201521038

2015-05-09

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100904）

谢俊华（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。E-mail：jhxie6@163.com

*通信作者：聂少平（1978—），男，教授，博士，研究方向为食品化学与分析、食品营养与安全、食品复杂碳水化合物。

E-mail：spnie@ncu.edu.cn