茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶活性的抑制作用

刘天囡，徐梦佳，胡 冰，费群勤，徐冬兰，曾晓雄

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶活性的抑制作用

刘天囡，徐梦佳，胡 冰，费群勤，徐冬兰，曾晓雄*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

以湖南茯砖茶为原料通过热水浸提、树脂吸附分离得到茯砖茶多酚类物质，并采用酶动力学和荧光猝灭分析方法探讨了茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制作用。结果表明：茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶有抑制作用，半抑制浓度（IC50）为0.81 mg/mL，抑制类型为可逆非竞争性抑制，其抑制常数Ki为2.56 mg/mL。荧光光谱分析表明茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶具有荧光猝灭效应，与茯砖茶多酚类物质的结合可能造成了酶结构的改变，从而降低了酶的催化活性。

茯砖茶；多酚；胰脂肪酶；抑制作用

自古以来茶叶是备受人们喜爱的饮品之一，其与人们的生活息息相关。随着人们生活水平的提高，茶叶的降血脂[1-3]、降血压[4-6]、抗动脉粥样硬化[7]等多种生物活性也日益得到重视。黑茶属于我国六大茶类之一，是后发酵茶，也是我国特有的茶类。黑茶中含有多种活性物质，其中茶多酚为主要活性成分，约占黑茶干质量的10%～30%[8-9]。张忠[10]的研究表明茶多酚具有抑制胰脂肪酶活性的作用，也有研究发现黑茶可以显著降低胆固醇水平、甘油三酯含量和血清脂蛋白含量[11]。

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一类特殊的酯基水解酶，它催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯[12]。胰脂肪酶是脂肪水解过程中的关键酶，抑制胰脂肪酶的活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，达到控制和治疗肥胖的目的。如朱晓青等[13]报道荷叶中的生物碱是胰脂肪酶的非竞争抑制剂，边金霖等[14]发现雅安藏茶具有抑制胰脂肪酶的作用，绿茶和白茶中的茶多酚能够有效地抑制胰脂肪酶的体外活性，对控制肥胖起到较好的效果[15]。因此，探究茯砖茶中多酚类物质对胰脂肪酶活性的影响，进一步阐述茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制作用机理，对探讨其降脂作用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

特制茯砖茶 湖南中茶茶业有限公司。

聚酰胺树脂 无锡临江化学试剂厂；无水乙醇、Na2CO3、乙酸钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris） 南京化学试剂股份有限公司；猪胰脂肪酶（TypeⅡ） 美国Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯基月桂酸酯（p-ntrophenyllaurate，pNP Laurate） 东京化成工业株式会社；Triton X-100 北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；Synergy-2酶标仪 美国Biotek公司；Heidolph Laborota 4000真空旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；EPED-E2-10 TH实验室级超纯水器 南京易普易达科技发展有限公司；V-1200型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；F-7000型荧光分光光度计 日本Hitachi公司；HH-4 数显恒温水浴锅 江苏常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茯砖茶多酚类物质的制备及含量测定

称取适量茯砖茶样品，以1∶16（m/V）料液比加入超纯水，在96 ℃恒温水浴锅中振荡浸提40 min，取上清液[16]，茶渣用相同方法再次浸提，合并两次上清液并抽滤去杂质，浓缩、冻干，得到茯砖茶水浸提物。重复上述操作至得到茯砖茶上清液，加入聚酰胺树脂，静置吸附24 h，抽滤取树脂，加入体积分数为80%的乙醇，解吸附24 h后抽滤，取液体并浓缩、冻干，得茯砖茶多酚类物质。

总多酚含量采用Folin-酚法[17-18]测定。以747 nm波长处的吸光度为纵坐标，质量浓度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）为横坐标绘制没食子酸标准曲线回归方程为：y＝10.276x+0.019 7（R2＝0.998 7）。

1.3.2 胰脂肪酶活性测定及茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制作用分析

胰脂肪酶活性的测定参照Gordon等[19]的方法并稍作改进。在具塞试管中加入pH 8.2的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）350 μL、胰脂肪酶150 μL、样品溶液50 μL，37 ℃条件下预热10 min后加入450 μL pNP Laurate底物，混匀，于37 ℃条件下避光反应120 min，16 000 r/min离心3 min，405 nm波长处测定上清液的吸光度。对照组用缓冲液代替样品液，每组实验重复3 次。

采用上述实验方法，改变茯砖茶多酚类物质样品的质量浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL），测定各反应的吸光度，根据公式（1）计算各样品的抑制率。以样品质量浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，进行多元非线性拟合，再利用回归方程求出茯砖茶多酚类物质样品的半抑制浓度（IC50）。空白对照组采用PBS缓冲液替代，所有实验重复3 次。

式中：A1、A2分别为空白对照和不同样品溶液在405 nm波长处的吸光度。

1.3.3 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶抑制类型的确定

在半抑制浓度条件下，加入不同质量浓度梯度的酶溶液，参考1.3.2节方法进行反应测定反应的吸光度，确定反应速率；固定抑制剂及酶的质量浓度，改变底物溶液的质量浓度，得出一系列吸光度。按Lineweaver-Burk双倒数作图法，以底物质量浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，反应速率的倒数（1/v）为纵坐标，绘制双倒数曲线图，确定其动力学特征及其最大反应速率（Vmax）、米氏亲和常数（Km）和解离常数（Ki）。对照组采用缓冲溶液替代，每组实验重复3 次。

茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制常数通过公式（2）进行计算：

式中：ρ为抑制剂的质量浓度／（mg/mL），而α通过公式（3）进行确定。

式中：Vmax是没有加入抑制剂的最大反应速率/（mg/（mL·min））；是加入抑制剂的最大反应速率/（mg/（mL·min））。

1.3.4 荧光猝灭实验

在20 ℃、pH 6.9条件下，固定发射波长（λem）为250～500 nm，激发波长（λex）为200～400 nm[20]，用荧光分光光度计分别扫描酶溶液、PBS和样品的3D荧光光谱图，然后在相同条件下，将一定质量浓度的多酚类物质样品溶液加入到酶溶液中，反应1 min后进行3D荧光光谱扫描。

2 结果与分析

2.1 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制作用

经测定，茯砖茶水浸提物和茯砖茶多酚的总多酚含量分别为25.8%和50.7%。该结果表明聚酰胺树脂吸附分离法能有效除去茯砖茶水浸提物中的杂质，可以从茶汤中分离吸附多酚类物质[21-23]，提高样品中多酚类物质的含量。

傅冬和等[24]研究发现茯砖茶不同萃取物对胰脂肪酶活性的影响程度不同，三氯甲烷萃取物有抑制作用，而水浸提物、乙酸乙酯及正丁醇萃取物有激活作用。由图1可知，在一定范围内，抑制剂质量浓度越大，抑制效果越好，而且抑制率曲线随着抑制剂质量浓度的增大而趋于平缓，说明茯砖茶多酚对胰脂肪酶最终总体表现为抑制作用。进行多元非线性拟合，可以得到茯砖茶多酚对胰脂肪酶的半抑制浓度（IC50）为0.81 mg/mL（表1）。据报道，茶多酚对胰脂肪酶的IC50为1.16 mg/mL[10]，霍世欣等[25]发现荷叶黄酮化合物对胰脂肪酶的IC50为0.007 6 mg/mL。因此茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制效果比普通市售茶多酚和荷叶黄酮化合物要差。本实验得到的是茯砖茶多酚类物质，其有效活性单体物质的抑制作用有待进一步研究。

图1 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of Fuzhuan brick tea polyphenols on pancreatic lipase

表1 茯砖茶多酚类物质的半抑制浓度及动力学参数Table 1 Half inhibitory concentration and kinetic parameters of Fuzhuan brick tea polyphenols

2.2 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制类型

根据抑制剂与酶结合的方式和特点不同，抑制类型可分为可逆抑制和不可逆抑制两种类型。由图2可知，当反应体系中有茯砖茶多酚类物质抑制剂存在时，其速率直线通过原点（误差允许范围内），由此可推断茯砖茶多酚类物质作为抑制剂对胰脂肪酶的抑制类型为可逆性抑制，与黄芩苷和米胚芽中物质的抑制类型相似[26-27]。

图2 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的抑制类型Fig.2 Inhibition type of Fuzhuan brick dark tea polyphenols on pancreatic lipase

可逆性抑制分为竞争性、非竞争性、反竞争性抑制3 种类型。在确定抑制机理时，利用Lineweaver-Burk的双倒数法作图，分别绘制抑制剂组和无抑制剂组的双倒数曲线图，确定两条直线的交点。由图3可知，两直线交于横轴，因此判断该反应的抑制类型为非竞争性抑制。并通过计算得出茯砖茶多酚类物质的Vmax、Km、Ki值（表1）。

图3 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶的可逆性抑制双倒数图Fig.3 Lineweaver-Burk plot of reversible inhibition of Fuzhuan brick tea polyphenols on pancreatic lipase

2.3 茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶荧光光谱的猝灭效应

图4 胰脂肪酶、PBS、抑制剂和不同质量浓度茯砖茶总多酚-酶混合物的3D荧光扫描Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectra of pancreatic lipase mixture with PBS, inhibitor and Fuzhuan brick tea polyphenols at various concentrations

蛋白质中由于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的存在使其具有内源荧光，并在发射波长和激发波长为340 nm和280 nm处有最大荧光峰[20]。Trp、Tyr以及Phe因为其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱，所产生荧光的强度和位置与这些残基所处的微环境密切相关[28-29]。通过对酶、PBS、抑制剂三者3D荧光扫描（见图4A～4C），结果表明PBS和抑制剂在测定范围内没有荧光值，不会造成干扰。由图4D～4G可知，当加入茯砖茶多酚类物质样品后，荧光光谱发生了猝灭，且随着茯砖茶多酚类物质样品质量浓度的增加，对胰脂肪酶的猝灭作用也增强，说明茯砖茶多酚类物质样品对酶蛋白所处的微环境产生了影响。Soares等[30]发现，酶为多畴结构，其结构域可以形成小空穴和缝隙。茯砖茶多酚类物质样品对酶蛋白所处微环境产生影响的原因可能是茶叶中的小分子物质儿茶素可以进入酶的空穴和缝隙与之结合，从而引起酶结构的改变，影响其催化效果。

3 结 论

本研究制备了茯砖茶多酚类物质并探究了其对胰脂肪酶的抑制作用，结果表明茯砖茶多酚类物质对胰脂肪酶有抑制作用，半抑制浓度（IC50）为0.81 mg/mL，抑制类型为可逆非竞争性抑制，抑制常数Ki为2.56 mg/mL。荧光猝灭实验表明茯砖茶多酚类物质能够引起胰脂肪酶的荧光光谱发生猝灭，酶蛋白所处的微环境有所变化，从而导致酶活性降低。

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Inhibitory Activity of Polyphenols from Fuzhuan Brick Tea on Pancreatic Lipase

LIU Tiannan, XU Mengjia, HU Bing, FEI Qunqin, XU Donglan, ZENG Xiaoxiong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Polyphenols from Fuzhuan brick tea were obtained through hot water extraction and resin adsorption-separation process, and their inhibitory effect on pancreatic lipase was investigated by using enzyme kinetic analysis and fluorescence quenching method. The results showed that the polyphenols from Fuzhuan brick tea had inhibitory activity on pancreatic lipase with half inhibitory concentration (IC50) of 0.81 mg/mL. The inhibition was a type of reversible non-competitive inhibition, and the constant of inhibition (Ki) was 2.56 mg/mL. The fluorescence quenching analysis showed that the polyphenols had quenching effect on pancreatic lipase, and they reduced the enzyme activity, possibly by changing its structure due to their bonding to pancreatic lipase.

Fuzhuan brick tea; polyphenol; pancreatic lipase; inhibition activity

TS272；TS201.3

A

1002-6630（2015）21-0046-04

10.7506/spkx1002-6630-201521010

2015-06-16

2013年江苏省科技支撑计划项目（BE2013313）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

刘天囡（1992—），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：2014808107@njau.edu.cn

*通信作者：曾晓雄（1964—），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zengxx@njau.edu.cn