卡介苗(BCG)感染对U937细胞系蛋白质乙酰化水平的影响

李 苗， 罗恩杰

(中国医科大学 基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110001)



卡介苗(BCG)感染对U937细胞系蛋白质乙酰化水平的影响

李 苗， 罗恩杰*

(中国医科大学 基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110001)

研究卡介苗(BCG)感染对U937细胞系蛋白质乙酰化水平的影响。构建U937巨噬细胞模型，感染BCG后提取细胞总蛋白，western blot方法检测细胞总蛋白乙酰化水平的改变。结果表明，在分化成熟的U937细胞系中，BCG感染能够上调蛋白质乙酰化水平，引起表观遗传学的改变。

卡介苗(BCG)；U937；乙酰化

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的慢性传染病，其发病率和死亡率均居重大传染病前列，严重威胁人类的健康和生命。Mtb是典型的胞内寄生菌，在感染早期主要寄生在肺泡巨噬细胞内，感染晚期主要寄生在肺巨噬细胞和树突状细胞内[1-2]。因此，体内的单核/巨噬细胞系统既是抵抗结核分枝杆菌感染的第一道防线，也是最关键的一道防线[3]。近年来关于病原体感染宿主细胞，引起表观遗传学的改变，从而调节基因转录状态的研究成为人们探讨感染性疾病病因学的又一新兴策略[4]。在众多表观遗传调控机制中，蛋白质的乙酰化发挥着尤为重要的作用[5-6]。本研究以卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)，一种活的减毒牛型结核分支杆菌疫苗为刺激因素，检测在分化成熟的巨噬细胞U937中蛋白质乙酰化水平的变化，从而为阐明结核病的发病机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和细胞 BCG(沈阳市疾控中心提供)，人淋巴瘤单核细胞系U937(来自中国科学院上海细胞生物学研究所)。

1.1.2 试剂 RBMI-1640培养基(invitrogen coropration 31800-022)，氟波酯PMA(Sigma Aldrich，美国)，小鼠抗乙酰化赖氨酸抗体(santa cruz，美国)，小鼠β-actin抗体(Cell Signaling Technology，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分化 用含10%胎牛血清的RPIM1640培养液培养U937细胞，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养； 取对数生长期的细胞；无抗生素培养液调整细胞数量至106个；转种至4块6孔板，每孔加入PMA 100 ng/mL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养孵育。48 h后观察细胞贴壁。去上清，加入无PMA完全培养基； 制备BCG悬液，按照BCG(MOI=1∶10)，刺激4 h。

1.2.2 抗酸染色法 用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2～3滴，在火焰高处徐徐加热3～5 min，待标本冷却后用水冲洗，3%盐酸酒精脱色30 s，用水冲洗后用碱性美兰溶液复染1 min，水洗，用吸水纸吸干后油镜观察。

1.2.3 Western blot印迹杂交 收集细胞，预冷的1×PBS洗2次，2 500 r/min，离心5 min。加入100 μL单去污裂解液(含PMSF)，冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清。每孔准备100 μg蛋白，加上样缓冲液煮沸5 min。上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中，100 V电泳约1.5 h。取出凝胶，于转印液中平衡30 min。4 ℃、40 V电转印过夜至PVDF膜。取出PVDF膜，1×PBS洗2～3 min，室温封闭2 h。应用特异性小鼠抗乙酰化赖氨酸抗体(1∶500稀释)或β-actin(1∶1 000稀释)，为一抗杂交2 h，加入1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG，室温杂交2 h。ECL显色，成像。

2 结果与分析

2.1 巨噬细胞模型的建立

人单核细胞系U937细胞正常状态下悬浮生长，镜下观察细胞呈圆形，细胞透亮(图1)。经PMA诱导分化的U937细胞形态发生变化(图2)，细胞发生贴壁，体积增大，呈团状聚集。

2.2 BCG感染分化成熟的U937细胞

以BCG(MOI=1∶10)感染分化成熟的U937细胞，抗酸染色法显示BCG进入细胞质中，见图3。

2.3 U937细胞蛋白质乙酰化水平的变化

BCG感染分化成熟U937细胞，提取感染后的总蛋白，进行Western blot实验，发现感染后总蛋白乙酰化水平高于对照组(图4)。

图1 U937细胞的正常生长状态Fig.1 The normal U937 cells

图2 U937细胞被PMA诱导分化后的形态Fig.2 The U937 cells differentiate into macrophage-like cells after a PMA treatment

图3 BCG感染U937细胞Fig.3 BCG infection of U937cells 抗酸染色法，箭头所示为BCGthe acid-fast staining method, an arrow shown in BCG

图4 BCG感染对细胞总蛋白乙酰化水平的影响Fig.4 Effect of BCG infection on the level of protein acetylation

3 讨 论

细菌与宿主细胞以及机体的相互作用关系决定了细菌感染和致病的分子基础。越来越多的研究表明，细菌感染能够引起细胞的组蛋白修饰和染色质重塑，从而改变宿主的转录程序。在众多转录调节方式中，乙酰化发挥着重要作用。共有两类酶参与调节蛋白质乙酰化状态，即组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)。HATs催化乙酰辅酶A的乙酰基团转移至组蛋白及一些转录相关因子的特定赖氨酸残基，导致转录因子与DNA的亲和力及转录活性的改变，从而调控基因表达水平[7]。HDAC在调节蛋白质乙酰化中的作用与HAT相反。这两类酶的平衡对维持蛋白质的正常乙酰化水平至关重要。

单核-巨噬细胞包括存在于血液中的单核细胞和组织中的巨噬细胞。单核细胞在血液中仅存留数小时至数日，然后移行至全身各组织并发育成熟为巨噬细胞。分枝杆菌进入机体后，可通过主动和被动两种机制定位于巨噬细胞中。在自然感染状态下，作为机体第一道防线的巨噬细胞会主动对进入的分枝杆菌进行吞噬。本实验采用U937作为细胞模型。U937来源于人的原始单核细胞，属于前单核细胞，以悬浮状态生长。用PMA诱导分化后，可以观察到细胞贴壁，并聚集成串，表示已成为成熟的巨噬细胞模型[8-9]。

应用BCG作为刺激因素，检测U937细胞中蛋白质的乙酰化水平。结果提示，BCG感染能够上调总蛋白乙酰化水平。在结核杆菌感染过程中，乙酰化水平的改变可能会导致相关基因表达水平的改变，从而影响结核病的发生和发展，并且将为阐明结核病的发病机制，预防和综合控制结核病的传播提供新思路。

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The Effect of BCG Infection on the Level of Protein Acetylation in U937 Cell Lines

LI Miao, LUO En-jie

(Teach. &Res.Div.ofPathog.Biol.,Coll.ofBasicMed.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110001)

The effect of BCG infection on protein acetylation level in U937 cell lines was studied. U937 macrophage model was constructed, and then total cellular protein was extracted after infected with BCG. Western blot was used to detect the changes of total protein acetylation level.The results showed that the BCG infection upregulated the protein acetylation level in matured differentiated U937 cells, and caused in epigenetic changes.

BCG; U937; acetylation

国家自然科学基金资助项目(81201333)

李苗 女，讲师，博士。研究方向为感染性疾病的表观遗传学。E-mail:sendtolm@126.com

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。研究方向为疟原虫的感染与免疫。E-mail：enjieluo@hotmail.com

2014-03-27；

2014-04-08

Q939.93； R379.91+1

A

1005-7021(2015)01-0046-03

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.01.009