蜂毒制剂“神蜂精”对佐剂性关节炎大鼠血管表皮生长因子及其受体的影响

程林兵龚雁王金胜缪晓青

(1福建农林大学蜂学学院；2福建蜂疗医院；3天然生物毒素国家地方联合工程实验室，福州，350002)

蜂毒制剂“神蜂精”对佐剂性关节炎大鼠血管表皮生长因子及其受体的影响

程林兵1,2，3龚雁1,3王金胜1,3缪晓青1,2,3

(1福建农林大学蜂学学院；2福建蜂疗医院；3天然生物毒素国家地方联合工程实验室，福州，350002)

目的：探讨“神蜂精”对佐剂性关节炎大鼠的治疗的可能机制。方法：60只SD雄性大鼠进行随机性分组，分为正常组、模型组、“神蜂精”高剂量组(1.0mL/kg/d)、“神蜂精”中剂量组(0.5mL/kg/d)、“神蜂精”低剂量组(0.25 mL/kg/d)、阳性组(复方醋酸地塞米松乳膏给药组，1.0g/kg/d)，每组10只。除正常组外，其余组大鼠右后足跖皮下注射完全弗氏佐剂诱导产生佐剂性关节炎(AA)。造模14 d后连续给药28 d。测量注射足足肿胀体积，采用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定大鼠血清中血管表皮生长因子(VEGF)、血管表皮生长因子受体-1(VEGFR-1)及血管表皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的含量。结果：(1)与模型组相比，“神蜂精”治疗组均能显著降低大鼠注射足足爪肿胀度(p＜0.01)；(2)与模型组相比，“神蜂精”高剂量组、中剂量组大鼠血清中VEGF和VEGFR-1含量，极显著降低（p＜0.01，p＜0.05）；(3)各组大鼠血清中VEGFR-2的含量无统计学差异(p＞0.05)。结论：“神蜂精”明显的抑制佐剂性关节炎大鼠足部炎症，降低血清VEGF及VEGFR-1的表达，从而减轻关节病理性血管新生。

“神蜂精”；佐剂性关节炎；类风湿关节炎；VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病，其主要病症是慢性炎症，进一步产生滑膜增生、血管翳生成，最终导致关节和软骨破坏[1]。血管表皮生长因子是一种能特异性促进血管内皮细胞增殖、维持血管内皮细胞分化状态、提高微血管通透性的蛋白质[2]。它能促进血管内皮细胞的有丝分裂，从而促进新生血管的形成；增强血管通透性，促使血管内物质的渗出，从而刺激炎症的形成和发展[3]。VEGF结合到血管表皮生长因子受体上发挥血管生成调节作用，血管表皮生长因子受体主要有VEGFR-1和VEGFR-2[4]。“神蜂精”是一种蜂毒、蜂胶及乳香、九里香、穿山龙等中药制成中药外用制剂。研究证明“神蜂精”消炎镇痛、调节免疫、祛风除湿、通经散寒、行气活血、促进损伤组织修复等作用[5,6]。前期实验证明“神蜂精”可缓解大鼠佐剂性关节炎(AA)炎症，减轻免疫器官病变，影响AA大鼠血清中各种细胞因子和炎性介质的表达。本研究通过观察“神蜂精”对AA大鼠血清中血管表皮生长因子(MMP-2)、血管表皮生长因子受体-1(VEGFR-1)及血管表皮生长因子受体-2(VEGFR-2)含量的影响，旨在进一步探讨该药治疗RA作用机理。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体质量130±20 g，由上海斯莱特实验动物中心提供。实验室环境：动物分别饲养在笼中，室温为23±1℃，湿度为55±5%，白天与黑夜交替各12 h。动物自由进食和进水。

1.2 药物与试剂

卡介苗(50 mg/支)：上海市生物制品研究所；不完全弗氏佐剂(10 ml/瓶)：美国sigma公司；复方醋酸地塞米松乳膏(20 g/支，含地塞米松15 mg)：华润三九医药股份有限公司，生产批号：1203007H；“神蜂精”(10 ml/瓶)：福建省神蜂科技有限公司，生产批号：SF000204130401，闽药制字Z20100001。VEGF酶联免疫吸附试剂盒：南京建成生物研究所提供。VEGFR-1酶联免疫吸附试剂盒：南京建成生物研究所提供。VEGFR-2酶联免疫吸附试剂盒：南京建成生物研究所提供。

1.3 主要仪器

YLS-足肿胀测量仪；电子天平；电热恒温水浴箱；漩涡混合仪；离心机；酶标仪等。

2 实验方法

2.1 动物分组

60只SD雄性大鼠，随机分为6组，即正常组、模型组、阳性组（复方醋酸地塞米松给药组）、“神蜂精”高剂量组、“神蜂精”中低剂量组、“神蜂精”低剂量组，每组10只。

2.2 AA大鼠模型的建立和给药

取卡介苗50 mg，80℃水浴灭活1 h后，加入不完全弗氏佐剂10 ml，混匀，充分乳化，直至将其滴在水面上不散开为止，即为完全弗氏佐剂(Complement Freund's Adjuvant,CFA)，浓度为10 mg/mL。

取用体积分数为75%的乙醇，对大鼠的右后足进行消毒。除正常组之外，其余组的大鼠每只右后足跖皮下注射0.1 mL CFA。正常组的大鼠则注射等量的生理盐水。设定注射当天为第1 d。

造模14 d后，正常组大鼠不做任何处理，而对其余各组大鼠注射足进行外部涂抹给药。其中模型组每只大鼠涂抹0.5 mL/kg/d生理盐水；“神蜂精”高、中、低剂量组每只大鼠分别涂抹1.0 mL/kg/d、0.5 mL/kg/d和0.25 mL/kg/d“神蜂精”；阳性组每只大鼠涂抹1.0 g/kg/d复方醋酸地塞米松乳膏。各组均连续给药28 d。

2.3 大鼠体重及足跖体积的测量

各组大鼠分别于造模前、造模后d6，d12，d18，d24，d30测量大鼠体重。各组大鼠分别于致炎前、致炎后d15，d21，d27，d33，d39用足趾肿胀测量仪测量大鼠足跖体积，求出足肿胀度(公式如下)。

2.4 大鼠外周血的采集和处理

所有大鼠于末日给药24 h后，称重，腹腔注射戊巴比妥钠30 mg·kg－1麻醉，眼眶取血约3 mL，静置30 min后，3000 rpm离心15 min，分离血清，-20℃保存。

2.5 大鼠血清中VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2含量测定

大鼠血清中VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2含量分别采用VEGF酶联免疫吸附试剂盒、VEGFR-1酶联免疫吸附试剂盒、VEGFR-2酶联免疫吸附试剂盒测定。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.6 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件处理。实验数据用平均值±标准差表示，组间差异用单因素方差分析。p＜0.05定为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 “神蜂精”对AA大鼠足肿胀度的影响

“神蜂精”对AA大鼠足肿胀度的影响实验和统计结果显示：给药前(d15)，与模型组相比，各组大鼠足肿胀度无统计学差异(p＞0.05)。给药后(d21)时，与模型组相比，“神蜂精”高剂量组足爪肿胀度降低(p＜0.05)，阳性组大鼠足肿胀度显著降低(p＜0.01)，其余组则无统计学差异(p＞0.05)；给药后d27、d33、d37时，“神蜂精”高、中、低剂量组和阳性组均可明显抑制AA大鼠足肿胀，与模型组比较，有极显著性差异(p＜0.01)。这说明“神蜂精”对AA大鼠有抗炎作用。

3.2 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGF含量的影响

“神蜂精”对AA大鼠血清中VEGF的影响实验和统计结果显示：与正常组相比，模型组大鼠血清VEGF含量极显著增加（p＜0.01）。“神蜂精”高剂量组大鼠血清中VEGF含量，与模型组比较极显著降低（p＜0.01），“神蜂精”中剂量组和阳性组大鼠血清中VEGF含量，与模型组比较有显著性差异（p＜0.05）。

3.3 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGFR-1含量影响

“神蜂精”对AA大鼠血清中VEGFR-1的影响实验和统计结果显示：与正常组相比，模型组大鼠血清VEGFR-1含量极显著增加（p＜0.01）。“神蜂精”高剂量组大鼠血清中VEGFR-1含量，与模型组比较极显著降低（p＜0.01），“神蜂精”中剂量组和阳性组大鼠血清中VEGFR-1含量，与模型组比较有显著性差异（p＜0.05）。

3.4 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGFR-2含量影响

“神蜂精”对AA大鼠血清中VEGFR-2的影响实验和统计结果显示：各组大鼠血清中VEGFR-2含量无统计学差异（p＞0.05）。

表1 “神蜂精”对AA大鼠足肿胀度(mL)的影响

表1 “神蜂精”对AA大鼠足肿胀度(mL)的影响

注：与模型组相比Ap＜0.01，a p＜0.05

组别给药后(d21)给药后(d27)给药后(d33)给药后(d39)给药前(d15)正常组0.1811±0.02150.2122±0.01840.2400±.02270.2755±0.02250.3233±0.0177模型组1.8113±0.08811.8114±0.12331.7985±0.12231.7475±0.10441.7744±.1053阳性组1.7767±0.08801.4677±0.0466A1.3088±0.0832 A1.1566±.0329 A0.9910±0.0216 A高剂量组1.7711±0.09081.5578±0.0356 a1.3877±0.0475 A1.1411±.0345 A0.9540±0.0691 A中剂量组1.7555±0.04111.6066±0.04661.4060±0.0289 A1.2822±.0692 A1.0133±0.0311 A低剂量组1.7600±0.05571.6677±0.03921.4100±0.0671 A1.2060±.0514 A1.0550±0.0696 A

表2 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGF含量的影响

表2 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGF含量的影响

注：与正常组相比A p＜0.01，a p＜0.05，与模型组相比B p＜0. 01，b p＜0.05

组别剂量（mg/kg）动物只数VEGF(pg/mL)正常组-1079.8906±5.1328 B模型组-10124.4910±7.3557 A阳性组1.0mg/kg1091.3243±6.44658b“神蜂精”1.0mL/kg1084.1213±3.1558 B“神蜂精”0.5mL/kg1099.2471±11.5752 b“神蜂精”0.25mL/kg10106.6180±3.9813

表3 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGFR-1含量的影响

表3 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGFR-1含量的影响

注：与正常组相比A p＜0.01，a p＜0.05，与模型组相比B p＜0. 01，b p＜0.05

组别剂量（mg/kg）动物只数VEGF-1(pg/mL)正常组-10195.9191±13.7342B模型组-10318.7605±10.1967A阳性组1.0mg/kg10236.8791±12.5753b“神蜂精”1.0mL/kg10200.1531±15.2766B“神蜂精”0.5mL/kg10240.0264±9.6647b“神蜂精”0.25mL/kg10265.7083±12.5643

4 讨论

大鼠足肿胀度是反映AA大鼠炎症程度的主要指标[7,8]，可以评价“神蜂精”对AA大鼠是否具有抗炎作用。在本研究造模期间，AA大鼠的足爪肿胀出现了两次高峰，与文献[9,10]所报道的AA大鼠经历的几个阶段性变化基本相似，模型组大鼠足肿胀度明显高于正常对照组，表明AA大鼠模型复制成功。AA大鼠的足肿胀度结果显示，给药初期，高剂量“神蜂精”和阳性药物的治疗效果更为明显。但是随着给药周期变长，“神蜂精”各组和阳性组消肿效果无显著差异性。根据以上研究结果表明“神蜂精”具有抗炎作用。

RA是一种自身免疫性疾病，该病变呈持续性和反复性，损害大，致残率高。血管翳形成是RA主要病理特征，而血管翳产生和维持的必要条件是血管新生[11]。临床研究发现，RA患者关节内血管新生的程度与患者炎症、关节损坏程度呈正比[12]。药物在治疗RA的过程中，除了控制炎症外，还要起到缓解关节骨和软骨的腐蚀的作用，从而保护患者的关节病变。因此血管新生抑制作用就成为开发RA药物的新思路之一。血管内皮生长因子(VEGF)及其受体、血管生成素及其受体、金属蛋白酶类等多肽类生长因子相互作用，共同参与RA血管新生过程[13]。VEGF在关节炎的形成及病理进展过程中有极其重要的作用。VEGF的主要靶细胞是血管内皮细胞，通过增加血管内皮细胞的有丝分裂，促进新生血管形成，通过增强血管的通透性，促进炎性渗出，进而促进炎症的形成和发展[13]。VEGF通过和血管内皮细胞的特异性受体结合，具有强大的促内皮增殖、促血管生成作用[14]。董文娟等[15]研究了穿山龙总皂苷对实验性关节炎滑膜血管新生的影响，发现模型组大鼠滑膜新生血管增多，VEGF及其受体表达升高，穿山龙总皂苷治疗后可能通过抑制VEGF及其受体表达来发挥血管新生抑制作用。史永博等[16]研究仙龙颗粒对AA大鼠的治疗作用及其机制，结果表明仙浓颗粒可能通过降低AA大鼠血清中VEGF含量，抑制血管新生，降低血管通透性，而起到治疗作用。本研究结果显示，模型组大鼠血清中VEGF和VEGFR-1含量显著增加，一定剂量“神蜂精”治疗之后，大鼠血清中VEGF和VEGFR-1含量显著降低。而各组大鼠血清中VEGFR-2含量无统计学差异。

综上所述，本研究提示“神蜂精”明显的抑制佐剂性关节炎大鼠足部炎症，降低血清VEGF及VEGFR-1的表达。其作用机制可能与通过抑制VEGF/VEGFR-1途径，抑制血管新生有关。

表4 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGF－2含量的影响

表4 “神蜂精”对AA大鼠血清中VEGF－2含量的影响

注：与正常组相比A p＜0.01，a p＜0.05，与模型组相比B p＜0.01，b p＜0.05

组别剂量（mg/kg）动物只数VEGF-2(pg/mL)正常组-10153.6230±14.0809模型组-10187.3858±8.5986阳性组1.0mg/kg10163.2723±7.0281“神蜂精”1.0mL/kg10167.2454±9.7800“神蜂精”0.5mL/kg10171.1977±10.7803“神蜂精”0.25mL/kg10162.0283±13.3868

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Effects of Bee Venom Preparation Shen Fengjing on Inflammatory Mediators in Adjuvant Arthritic Rats

Cheng Linbing1,2Gong Yan1Wang Jingsheng1Miao Xiaoqing1,2,3
(1 College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,350002;2 Fujian Apitherapy Hospital,Fuzhou,350002;3 State and local Joint Engineering Laboratory of Natural Biotoxin,Fuzhou,350002)

Objective：To investigate the mechanism of Shen Fengjing(SFJ)for adjuvant arthritic(AA)rats．Methods: Complete Freund's adjuvant(CFA)was injected to induce experimental arthritis in rats.60 SD male rats were randomly divided into the normal group,model group,SFJ high-dose group,SFJ middle-dose group,SFJ low-dose group, Compound Dexamethaso(CD)group with 10 rats in each.A model of experimental adjuvant-induced arthritic rats(AA rats)was established in the latter five groups.After 14 days,the six groups were treated with normal saline,1.0mL/kg SFJ and 0.5,0.25mL/kg SFJ,1.0g/kg CD by local treatment for 28 days.Paw swelling degree of AA rats was measured. The content of vascular endothelial growth factor,vascular endothelial growth factor receptor-1 and vascular endothelial growth factor receptor-2(VEGF,VEGFR-1,VEGFR-2)in serum were measured by Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)kits.Results:(1)Compare with the model group,all SFJ-treated groups significantly decreased the paw swelling degree(p＜0.01);(2)Compare with the model group,High SFJ-treated group and middle SFJ-treated group significantly decreased the content of VEGF and VEGFR-1 in the serum of rats(p＜0.01,p＜0.05);(3)Compare with the model group,the content of VEGFR-2 in the serum of all groups had no significant difference(p＞0.05).Conclusions:SFJ could significantly inhibit the inflammation of the AA rats,and decreased the content of VEGF and VEGFR-1 of AA rats,then reduced joint pathological?angiogenesis.

Shen Fengjing;rheumatoid arthritis;adjuvant arthritis;paw swelling degree;VEGF;VEGFR-1; VEGFR-2

福建省科技厅资助(No 2012D078)

程林兵，男，副研究员，研究方向：蜂疗。

缪晓青，男，教授，博士生导师，福建农林大学蜂疗研究所所长，E-mail:mxqsf88@126.com。