响应面法优化鹿角菜中岩藻多糖的超声波辅助提取工艺*

宋海燕，何文辉，张泽华，袁荣荣

(上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海，201306)

鹿角菜(Pelvetia siliquosa Tsenget C.F.Chang)隶属褐藻门(Phaeophyta)、圆子纲(Cyclosporeae)、鹿角菜目(Fucales)、鹿角菜科(Fucaceae)、鹿角菜属(Pelvetia)［1］。鹿角菜藻体骨小，软骨质，叉状分枝角度较宽，生长托是长角果形［2］。岩藻多糖是褐藻中重要的杂多糖，其主要单糖组成是L-岩藻糖，是一种硫酸多糖。

多糖提取的常用方法有热水提取、超声辅助提取和微波辅助提取法，其中选用超声波辅助提取是因为其能耗低、溶剂消耗低、提取效率较高以及自动化程度高［3-4］。当今，优化提取工艺以获得最大多糖提取率已成为研究热点［5-8］。Box-Benhnken设计(BBD)是一个球形旋转设计，与传统方法相比，简化了需要评估多个变量和它们之间的相互作用试验的复杂性，已被广泛应用于优化提取工艺，获得最佳多糖提取率的最佳工艺参数组合［9-11］。

本试验以鹿角菜为原材料，采用超声波辅助提取鹿角菜中岩藻多糖，通过响应面法来优化提取工艺，同时采用自由基清除能力体系来对岩藻多糖进行体外抗氧化活性研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

鹿角菜(Pelvetia siliquosa Tsenget C.F.Chang)产自海南，已在试验室人工饲养;L-岩藻糖标准品(Fuc)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;重蒸酚，生工生物工程(上海)股份有限公司。无水乙醇、体积分数95%乙醇、浓 H2SO4、三氯甲烷、正丁醇、K3Fe(CN)6、三氯乙酸、FeCl3、DPPH、抗坏血酸(Vc)、水杨酸、邻苯三酚、三羟基氨基甲烷(Tris)等均为分析纯。

JY92-2D超声波细胞破碎机，宁波新芝科器研究所;SP-722可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;SXT-06索氏提取器，上海洪纪仪器设备有限公司;DK-S24型电热恒温水浴锅，上海精宏试验设备有限公司;LXJ-IIB低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂;美国LABCONCO冷冻干燥机，无锡凯派克斯科技有限公司;R-201型旋转蒸发仪，上海申胜生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 岩藻多糖提取工艺研究

鹿角菜洗净晾干，-80℃预冻24 h，冷冻干燥24 h，研磨粉碎过60目筛，用95%乙醇90℃回流脱脂3次，每次4 h，40℃烘干得脱脂藻粉。

脱脂藻粉加入适量蒸馏水溶胀，超声波辅助提取后，水浴处理一段时间，提取液冷却至室温，4 000 r/min离心20 min后，弃沉淀，浓缩上清液至1/5体积，冷却后加无水乙醇至浓度为30%，以除去褐藻胶，静置1 h，4 000 r/min离心20 min，浓缩上清液至1/5体积，加4倍体积95%乙醇，4℃静置过夜，4 000 r/min离心，收集沉淀，用无水乙醇洗涤数次，冷冻干燥得粗岩藻多糖。

1.2.2 岩藻多糖含量的测定

制备标准曲线［12］:取 L-岩藻糖标准品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加蒸馏水至 2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，混匀后，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，静置5 min，沸水浴加热20 min后，冷却至室温。490 nm处测吸光度，以L-岩藻糖的浓度(c，mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为:Y=0.0198 c+0.052 7，R2=0.997 6。

样品溶液的制备:取1 mL样品溶液，置于试管中，加蒸馏水至2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，混匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，静置5 min，沸水浴加热20 min后，冷却至室温。490 nm处测定吸光度，根据回归方程计算粗岩藻多糖提取率［公式(1)］。

1.3 响应面法试验设计

在单因素试验的基础上，选取超声时间、料液比、水浴温度以及水浴时间4因素进行响应面试验。响应面因素水平见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Analytical factors and levels for RSM

1.4 粗岩藻多糖初步处理

配制2%的粗岩藻多糖溶液，并加入1/3糖溶液体积的 Sevag试剂［V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1］，剧烈振荡30 min，离心5 000 r/min，10 min，上层水相含多糖，下层为有机相，去除有机相层和蛋白质沉淀层，水相按照此方法反复除蛋白至两相间没有白色蛋白质。将脱蛋白后的多糖溶于蒸馏水，借助磁力搅拌，连续透析24 h，每4换水。浓缩后冷冻干燥得初纯岩藻多糖(F)。

1.5 岩藻多糖抗氧化活性试验

1.5.1 岩藻多糖的羟自由基(·OH)清除能力测定

双氧水与二价铁发生Fenton反应生成羟自由基，加入岩藻多糖后会和水杨酸竞争与羟自由基的结合，从而使有色产物减少，该产物在510 nm处吸收值最大，可以采用紫外分光光度计测定510 nm处的吸光值来评定。

根据孙海森的方法［13］，将岩藻多糖稀释成不同浓度梯度:0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL。取6 mmol/L水杨酸，2 mmol/L 的 FeS04各1 mL，摇匀，再加入1 mL的 6 mmol/L H2O2，摇匀，于37℃水浴恒温15 min后，测定其吸光度A0。之后，各加入岩藻多糖溶液1 mL，摇匀，放置10 min，测定其吸光度A1，并用水代替H2O2的A2做参照，按公式(2)计算清除率。同时以相同浓度的Vc作为对照。每个处理设置3个重复。

式中:A0为空白对照的吸光值;A2为多糖本底吸光值;A1为岩藻多糖样品的吸光值。

1.5.2 岩藻多糖的超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力测定

碱性条件下，邻苯三酚经自氧化产生中间产物O2-·，它会加速邻苯三酚的自氧化反应。参照娄翠的方法［14］，分别将岩藻多糖和Vc配成不同质量浓度梯度:0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL。取 5 mL Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2，50 mmol/L)，25 ℃预热30 min，加入2 mL不同质量浓度的多糖溶液和Vc溶液，25 mmol/L邻苯三酚溶液0.6 mL，混合均匀后在25℃的水浴条件下反应10 min，再加入8 mol/L的HCl溶液3 mL来终止反应，在320 nm处测定吸光度。以蒸馏水为对照。O2-·的清除能力按公式(3)计算:

式中:A0、A1、Ai分别为空白对照、岩藻多糖样品、不加邻苯三酚溶液的吸光度值。

1.5.3 DPPH法测定岩藻多糖的抗氧化能力

参考郭欣的测定方法［15］，取1 mL不同质量浓度梯度样品溶液(0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL)，0.2 mL DPPH溶液，以及2 mL蒸馏水，混匀，常温下30 min后，在515 nm出测定吸光度A1，用蒸馏水代替样品得到吸光度A0，无水乙醇代替样品得到吸光度A2［公式(4)］。同时以相同浓度的Vc作为对照。每个处理设置3个重复。

1.5.4 岩藻多糖的还原力测定

采用Amarowicz方法［16］，并稍做调整。取pH 6.6的0.2 mmol/L磷酸钠缓冲液和1%的铁氰化钾溶液各2.5 mL，加入不同质量浓度梯度的样品溶液(0.05，0.2，0.8，1.0，2.0，4.0 mg/mL)1 mL，混匀后50 ℃水浴20 min。加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，5 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL，再加入0.1%FeCl32.5 mL，混匀，在避光处静置10 min后于700 nm波长处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 响应面试验设计与结果

采用Box-Benhnken设计对岩藻多糖提取工艺进行响应面分析，响应面试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Design and experimental results of RSM

2.2 数学模型建立与数据分析

利用Design Expert8.05软件对表2中数据进行拟合，得到岩藻多糖提取率(Y)对试验因素的二次回归方程如下所示:

Y=-141.130 78+1.715 42A+0.614 08B+1.352 44C+7.511 35D+6.481 50×10-4AB-2.374 00×10-4AC-0.011 364AD-1.109 00×10-3BC-5.702 75×10-3BD-9.595 00×10-4CD-0.013 969A2-5.145 13×10-3B2-7.033 04×10-3C2-0.648 38D2

二次回归方程中，A2、B2、C2、D2的系数均为负数，因而推断回归方程所对应的抛物面开口向下，说明有极大值点。由表3可知，回归模型项P＜0.000 1，说明该回归模型极显著，且模型失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.155 3＞0.05)，说明未知因素对该试验结果干扰小。决定系数R2=0.978 6，说明该二次回归模型与实际试验值拟合度较好且可靠性高。调整系数，说明该二次回归模型可以解释95.55%的响应值的变化。变异系数(C.V.%=3.71)有较低值，说明试验值可靠。信噪比(Adeq Precision)为18.552，说明精度很高。该回归方程模型拟合较好，可用于岩藻多糖的超声辅助提取工艺优化。

一次项中 A、B、C和 D均为差异极显著(P＜0.001)，说明在岩藻多糖提取工艺过程中，超声时间、液料比、水浴温度和水浴时间对岩藻多糖的提取有极其显著的影响，是岩藻多糖提取率的主要限制因子;由表3可以得出影响鹿角菜岩藻多糖提取率的顺序依次为超声时间(A)＞水浴温度(C)＞水浴时间(D)＞液料比(B)。

2.3 响应面三维图分析

图1显示了水浴温度和水浴时间在中心水平时，超声时间和液料比对超声辅助提取岩藻多糖提取率的影响。当超声时间在50～60 min范围，液料比在40～50(mL∶g)范围内，多糖提取率随着超声时间的延长，液料比的增加而不断提高，当超声时间和液料比超过中心水平时，提取率减少。且超声时间对多糖提取率的曲线更陡峭，说明超声时间影响更大，与表3结果相符。

图1 超声时间和液料比对岩藻多糖提取率影响的响应面图Fig.1 Response surface plot and contour plot of ultrasonic time and liquid-solid ratio on extraction of fucoidan

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis(ANOVA)for regression equation of model

图2和图3中三维曲面与图1相似，多糖提取率都是呈先增加后减小的趋势，且等高线为圆形，说明两影响因素交互作用不显著。

图2 超声时间和水浴温度对岩藻多糖提取率影响的响应面图Fig.2 Response surface plot of ultrasonic time and water bath temperature on extraction of fucoidan

图3 超声时间和水浴时间对岩藻多糖提取率影响的响应面图Fig.3 Response surface plot of ultrasonic time and water bath timeon extraction of fucoidan

图4、图5和图6中三维曲面相似，多糖提取率依然呈先增加后减小的趋势，由曲面可看出，变化幅度不大。等高线呈椭圆形，表明两者有交互作用，但由表3可知，两者交互作用并不显著。

图4 水浴温度和液料比对岩藻多糖提取率影响的响应面图Fig.4 Response surface plot of water bath temperature and liquid-solid ratio on extraction of fucoidan

2.4 最佳工艺参数确定与模型验证

由中心组合试验设计［17］优化得试验结果为A=59.78 min，B=50.75 mL/g，C=90.79℃，D=4.98 h，Y为5.993%。考虑实际操作，将提取条件修改为超声时间为60 min，液料比为51 mL/g，水浴温度为91℃，水浴时间为5 h。采用最佳提取条件，3次重复验证结果为5.966%，5.958%，5.960%，平均提取率为5.961%，与理论预测值相近。因此可以采用响应面法来优化岩藻多糖的提取工艺条件。

图5 水浴时间和液料比对岩藻多糖提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plot of water bath time and liquid-solid ratio on extraction of fucoidan

图6 水浴时间和水浴温度对岩藻多糖提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of water bath time and water bath temperature on extraction of fucoidan

2.5 超声波辅助提取法与传统水浴法对比

在单因素试验基础上对传统水提岩藻多糖工艺进行响应面优化得到最佳提取条件和提取率如表4，通过对比，在超声波辅助下，提取总时间缩短了2.4 h，多糖提取率提高了0.76%，这是因为超声波的作用提高了质量传递效率，促使细胞中多糖更易释放和扩散到溶剂中［18］。而水浴时间过长有可能导致多糖降解。

表4 超声波辅助提取法与传统水浴法对比Table 4 The comparison between Ultrasonic assisted extraction method and traditional water bath method

3 抗氧化活性结果与分析

3.1 羟自由基清除能力测定

在试验范围内，Vc和岩藻多糖对·OH的清除率随着质量浓度的增加而不断提高(图7)。在0.05～0.4 mg/mL范围内，Vc对·OH的清除率显著提高，当质量浓度为0.4 mg/mL时，清除率为97.93%。当多糖质量浓度低于0.2 mg/mL时，对·OH的清除率较低，但增幅明显。当质量浓度在0.2～1.0 mg/mL范围内，岩藻多糖对·OH的清除率从36.32%增加至77.47%，岩藻多糖和Vc半数抑制浓度IC50分别为0.346 mg/mL和0.101mg/mL岩藻多糖对·OH的清除能力较好但低于Vc。

图7 岩藻多糖和Vc对羟自由基的清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical cavenging activity of fucoidan and Vc

3.2 岩藻多糖的O-2·清除能力测定

在试验范围内，Vc和岩藻多糖对O2-·的清除率随着质量浓度的增加而不断提高(图8)。岩藻多糖质量浓度低于0.2 mg/mL时，对O2-·的清除率较低，当质量浓度在0.2～1 mg/mL范围内时，对O2-·的清除率增加较缓慢。当质量浓度为1 mg/mL时，Vc和岩藻多糖对O2-·的清除率分别为95.47%和52.87%。岩藻多糖和Vc半数抑制浓度IC50分别为0.893 mg/mL和0.268 mg/mL，岩藻多糖对O2-·清除作用低于水溶性Vc。

图8 岩藻多糖和Vc对O2-·的清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of fucoidan and Vc

3.3 DPPH法测定岩藻多糖的抗氧化能力

在试验范围内，当质量浓度低于0.6 mg/mL时，岩藻多糖对DPPH·的清除率高于水溶性Vc;岩藻多糖的半数抑制浓度IC50小于Vc，分别0.128 mg/mL和0.263 mg/mL;当浓度为1 mg/mL时，清除率为68.36%，略低于水溶性Vc对DPPH·的清除率(图9)。

图9 岩藻多糖和Vc对DPPH·自由基的清除能力Fig.9 DPPH·scavenging activity of fucoidan and Vc

3.4 岩藻多糖的还原力测定

还原力的大小成为衡量其抗氧化活性的重要指标之一，吸光度越大，还原力越大。Vc和岩藻多糖的还原力较好，随着质量浓度的增加，量效关系明显，当质量浓度在1～4 mg/mL范围内，岩藻多糖的吸光度增加缓慢，还原力趋于平稳。当质量浓度为4 mg/mL时，还原力为Vc的62.69%(图10)。

图10 岩藻多糖和Vc还原能力Fig.10 Reduce activity of fucoidan and Vc

4 结论

通过响应面分析法系二次回归方法，获得鹿角菜中岩藻多糖的最佳提取条件为超声时间60 min，液料比51(mL∶g)，水浴温度91℃，水浴时间5 h。通过方差分析确定该二次回归模型具有显著性，一次项对提取率的影响显著，四个参数的二次交互项虽存在交互作用，但均不显著。在最佳提取条件下，岩藻多糖提取率达到5.961%，与理想预测值(5.993%)相比，相对误差小于5%;通过与传统水提法相比发现，提取总时间缩短了2.4 h，多糖提取率提高了0.79%。对最佳提取条件所得岩藻多糖脱蛋白透析后进行抗氧化能力测定发现，岩藻多糖具有良好的抗氧化能力，还原力随着质量浓度的增加而不断提高，对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的半数抑制浓度 IC50分别为 0.346 mg/mL、0.893 mg/mL和0.128 mg/mL;但与Vc相比，对羟自由基、超氧阴离子自由基清除作用较弱，但对DPPH的半数抑制浓度IC50小于Vc。因此为鹿角菜中岩藻多糖在保健食品，医药开发提供了理论基础。

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