复合中药发酵乳的制备及其体外抗氧化性研究

王景晨，顾瑞霞，曹荣，韩抒

1(南京金陵中等专业学校，江苏南京，210000)2(扬州大学，江苏扬州，225127)

中药作为我国传统医学的文化遗产及国宝。中药中的黄酮、酚以及多糖具有较强的抗氧化活性，具有良好的保健功能，镇静催眠作用，抗肿瘤作用，抗炎，降血脂作用，而且其中含有多种益生因子能够促进乳酸菌及肠道益生菌的生长［1-4］。

研究人员从中药中选择了4种药食同源的中药——酸枣仁、决明子、枸杞子以及甘草，研究了4味中药对乳酸菌发酵的影响，优化了复合中药发酵乳的制备工艺，并对复合中药发酵乳的体外生物活性进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

酸枣仁、甘草、决明子、枸杞均购于扬州乐购超市;全脂奶粉为新西兰威士兰乳业公司产品;白砂糖为广西风糖生化股份有限公司产品;干乳酪杆菌(实验室自选分离菌种);DPPH自由基购自Sigma公司;无水乙醇、三氯乙酸、铁氰化钾、抗坏血酸、NaCl、FeCl2、FeSO4、水杨酸和EDTA，均为国药集团化学试剂有限公司产品;菲洛嗪购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 设备

电子天平，上海天平仪器厂;HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司;755S型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司生产;pHS-3B型精密pH计，上海雷磁仪器厂;康宝电磁炉，国华电器有限公司;SW-CJ-IF型无菌操作台，苏州安泰空气技术有限公司;组织捣碎匀浆机(JJ-2)，中外合资深圳天南海北有限公司;全自动黏度计(RVDV-Π)，美国BrooKfield Engineer in Laboratories，INC;10 速多功能搅拌器，佛山市三水合成塑料五金制品有限公司;微量移液器，Eppendorf公司;XW-80A旋涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司;其余均为常规仪器设备。

1.3 样品的制备

1.3.1 药液制备

以酸枣仁为例的药液煎煮方法:

决明子、枸杞子、甘草药液制备方法与酸枣仁相同。

1.3.2 中药发酵乳工艺

奶粉(蛋白质质量12.8%)→40～50℃的水溶解→加热至60～70℃加糖(6.5%)、加中药液→均质(20 MPa)→杀菌(95℃，5 min)→接种(3%)→发酵(40℃，3.5 h)→冷藏(4℃)

1.4 感官评定

组织15位具有一定专业知识的人组成评价小组，就发酵乳的感官进行评分。最高分10分，确定加权系数分别为色泽1分，组织状态3分，香气2分，滋味4分，最后得分为15位评分员评分的算术平均值。按表1方法对发酵乳进行感官评价，每个样品做3组平行试验，将平均值作为最终评价结果［5］。

表1 产品的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation Qandard for product

1.5 中药发酵乳产品质量的测定

蛋白质、脂肪和微生物指标等按GB 19302-2010 测定［6］。

酸度的测定:取菌种10.0 mL到250 mL的三角烧瓶中，再加入20 mL的蒸馏水和0.5 mL的酚酞溶液，摇匀，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，并在1min内不消失为止。记录0.1 mol/L的NaOH的溶液所消耗的体积(mL)。

1.6 发酵乳抗氧化活性的测定

用乳酸菌发酵添加复合4味中药和不添加中药来研究复合中药发酵乳的抗氧化活性。

1.6.1 DPPH自由基的清除能力

参照文献所述方法［7］，将两种乳酸菌发酵乳系稀释后，取滤液2.0 mL与2.0 mL体积分数为95%的乙醇混匀，再加入浓度为0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL于具塞试管中，摇匀，避光放置30 min后，3 000 r/min下离心10 min，用95%乙醇作参比测定其吸光度Ai。同时测定0.2 mmol/L DPPH溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度Ac，以及待测液与等体积95%乙醇混合液在517nm处的吸光度Aj。按公式(1)计算清除率:

式中:Ac，未加待测液时DPPH溶液的吸光度;Ai，加待测液时DPPH溶液的吸光度;Aj，待测液与95%乙醇混合液的吸光度。

1.6.2 羟基自由基(·OH)的清除能力

参照文献［10］所述方法，将2 mL的6 mmol/L硫酸亚铁水溶液与2 mL的6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液混合后，将不同稀释倍数的发酵乳加入后，再加入2 mL的20 mmol/L的过氧化氢溶液，混匀后在37℃的恒温水浴中反应1 h时，3 000 r/min下离心10 min，取出冷却后在510 nm处测定吸光值，每一吸光值平行测定3次，取其平均值。·OH清除率按公式(2)计算:

式中:A0，不含样品和H2O2;A1，不含样品，含H2O2;A2，含样品和 H2O2。

1.6.3 Fe2+螯合能力

参考Deeker［11］的方法并略做改进。取稀释后的2 mL待测液，加入2 mL 0.01 mmol/L FeCl2·4H2O溶液和2 mL 0.25 mmol/L菲洛嗪，振荡混匀。反应混合物静置10 min，在562 nm下测定吸光度，用双蒸水做空白对照。亚铁离子鳌合能力用公式(3)表示:

式中:Acontrol，不含样品;Asample，含样品。

1.7 数据处理

用SPSS17.0统计软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 中药的添加对干酪乳杆菌发酵特性的影响

2.1.1 酸枣仁浸提液添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响

以上述药液制备方法制备的酸枣仁浸提液，默认为1 mL浸提液相当于0.1 g酸枣仁。在4份还原奶中分别加入0，0.5%，1.0%，2.0%的酸枣仁浸提液，然后均质、杀菌、接种量3%、40℃发酵4 h、4℃下冷藏24 h，测定活菌数、酸度、pH值，结果见表2。

从表2中可以看出，添加酸枣仁浸提液对酸度、pH值、活菌数及感官都有很大的影响，对干酪乳杆菌有增菌作用。随着酸枣仁浸提液添加量的增加，酸度上升，pH值下降，活菌数上升。

表2 酸枣仁浸提液的添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响Table 2 The influence of Semen Ziziphi spinosae on the fermentation properties of Lactobacillus casei

2.1.2 决明子浸取液添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响

以上述药液制备方法制备的决明子浸提液，默认为1 mL浸提液相当于0.1 g决明子。由于决明子浸提液的色泽较深，且味苦涩，对口味的影响很大，故添加量较小。在4份还原奶中分别加入0，0.2%，0.4%，0.6%的决明子，其他工艺条件同2.1.1，测定结果见表3。

表3 决明子浸提液的添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响Table 3 The influence of Semen Cassia on the fermentation properties of Lactobacillus casei

由表3中可以看出，0.4%的决明子添加量效果较好。

2.1.3 枸杞子浸提液添加量对乳酸菌发酵特性的影响

以上述药液制备方法制备的枸杞子浸提液，默认为1 mL浸提液相当于0.1 g枸杞子。在4份还原奶中分别加入0、0.5%、1.0%、2.0%的枸杞子浸提液，其他工艺条件同2.1.1，测定活菌数、酸度、pH值，结果见表4。

由表4可以看出，枸杞子浸提液对干酪乳杆菌发酵特性的影响比较大，0.5%的添加量效果较好。

2.1.4 甘草浸提液添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响

以上述方法制备的甘草浸提液，默认为1 mL浸提液相当于0.1 g甘草。在4份还原奶中分别加入0，0.5%，1.0%，2.0%的甘草浸提液，其他工艺条件同2.1.1，测定活菌数、酸度、pH值，结果见表5。

表4 枸杞子浸提液的添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响Table 4 The influence of Fructus lycii on the fermentation properties of Lactobacillus casei

表5 甘草浸提液的添加量对干酪乳杆菌发酵特性的影响Table 5 The influence of Radix glycyrrhiza on the fermentation properties of Lactobacillus casei

从表5可以看出，由于甘草味甜，少量的添加对口味的影响不大。但是随着添加量的增加，酸度、pH值、活菌数以及发酵乳的感官等影响较大。添加量在1%时的感官较好、酸度较高。

2.1.5 复合中药配比优化

根据单一中药的试验结果，按表3～表8中的5种比例添加到还原奶中，其均质压力为20 MPa、接种量3%干酪乳杆菌、40℃发酵3.5 h、4℃下冷藏24 h，测定活菌数、酸度、pH值，经过重复测定，结果见表6。

表6 复合药的混合比例Table 6 The mixture ratio of compound herbal

由表7可以看出，②号和⑤号配方与①号相比，酸度升高，pH值下降，活菌数变化不大，可以认为这两个配方促进干酪乳杆菌产酸;③号和④号配方与①号相比，酸度下降，pH值下降，活菌数下降，可以认为这两个配方抑制干酪乳杆菌发酵。经感官评价后，一致认为⑤号口味较好，故选⑤号为最终配方。

表7 复合药比例对干酪乳杆菌发酵特性的影响Table 7 The influence of compound herbal on the fermentation properties of Lactobacillus casei

2.1.6 复合中药发酵乳储藏过程中的指标变化

按⑤号配方制做发酵乳样品，即酸枣仁2.0%、决明子0.2%、枸杞子0.5%、甘草1.0%、加糖量6.0%，对照组加糖6.5%，其他如均质压力、杀菌温度、杀菌时间、接种量、发酵温度、发酵时间均相同。进行冷藏试验。实验结果见图1、图2、图3。

由图1和图2可以看出，无论是样品组还是对照组都随冷藏时间的增加，pH值不断下降，而与此同时酸度不断增加。GB 19302-2010中规定，酸度应大于70.0 °T。

图1 酸度的变化曲线Fig.1 The acidity change curve

图2 pH值的变化曲线Fig.2 The pH change curve

图3 活菌数的变化曲线Fig.3 Theviable count change curve

由本试验可以看出，发酵乳制品在冷藏的第2天即发生后酸化，且随冷藏时间的增加，后酸化越来越严重。发酵乳的后酸化现象是由发酵剂菌体继续生长繁殖造成的，菌体要消耗残存的乳糖产生乳酸，故导致发酵乳制品酸度提高。

由图3可以看出，无论是样品组还是对照组，其菌数都随冷藏时间的增加而减少，这是因为发酵剂菌体本身的所处介质酸度较高，温度较低，使发酵剂菌体生长繁殖受到一定的抑制，所以菌数逐渐减少。

2.1.7 复合中药发酵乳的质量指标测定

按优化的工艺条件制备复合中药发酵乳，并对3批次产品质量按GB 19302-2010进行检测，结果见表8。本实验复合中药发酵乳组织均匀，口感细腻，酸甜适中，具有良好的中药香味和乳香;蛋白质含量＞2.3%，滴定酸度115°T左右;未检出致病菌。产品符合GB 19302-2010。

2.2 复合中药发酵乳抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH自由基的清除能力

普通发酵乳及复合中药发酵乳对DPPH自由基清除能力结果如图4。

由图4可以看出，不同浓度的复合中药发酵乳对DPPH自由基的清除能力高于普通发酵乳。中药中的抗氧化功效成分以及中药作为益生因子刺激了乳酸菌的生长，从而共同发挥了抗氧化作用。

表8 复合中药发酵乳质量指标Table 8 Quality index of the Chinese herbal fermented milk

图4 发酵乳清除DPPH自由基的能力Fig.4 Scavenging effect of fermented milk against the DPPH·radical

2.2.2 羟基自由基(·OH)的清除能力

由图5可以看出，复合中药发酵乳原液对·OH的清除能力最高，为75.43%;不同浓度的复合中药发酵乳和普通发酵乳对·OH的清除能力随稀释倍数的增大而降低，但复合中药发酵乳对·OH的清除能力普遍高于普通发酵乳。

图5 发酵乳清除·OH能力Fig.5 Scavenging effect of fermented milk against the hydroxyl radical

2.2.3 Fe2+螯合能力

将2种发酵乳分别稀释0倍、2倍、4倍、6倍、8倍后测量，结果见图6。

图6 发酵乳的Fe2+螯合作用Fig.6 Chelating effect of fermented milk

由表6看出，不同浓度的复合中药发酵乳对Fe2+的螯合能力不同，原液稀释8倍后，对Fe2+的螯合率为22.43%，高于普通发酵乳。不同浓度的复合中药发酵乳对Fe2+的螯合能力都高于普通发酵乳。

3 结论

通过对酸枣仁、决明子、枸杞子、甘草的预处理，研究了它们对发酵乳质量的影响，并确定了复合中药乳酸菌发酵乳的最优制备工艺，结果表明当酸枣仁、决明子、枸杞子、甘草的添加质量分数分别为2.0%、0.2%、0.5%、1.0%，干酪乳杆菌接种量为3%，发酵温度为40℃时，中药发酵乳在感官品质和稳定性方面都比较好。

通过发酵乳抗氧化实验发现，复合中药发酵乳原液对DPPH自由基清除率最高，为89.25%，且高于不添加中药的发酵乳。复合中药发酵乳在不同的稀释度对·OH的清除率均高于对照的普通发酵乳，复合中药发酵乳原液对·OH的清除率最大，为75.43%。

［1］ 杨君，陈合，彭丹，等.十种中药对发酵乳发酵菌生长的影响［J］.食品科技，2008，34(3):18-20.

［2］ 王成涛，籍保平，朱桂华，等.五味中药对乳酸菌生长及保存活力的影响［J］.中国微生态学杂志，2004，16(2):75-76.

［3］ 朱晓慧，唐宝英.中药对双歧杆菌生长的影响［J］.生物技术，2002，12(4):31-32.

［4］ CROW J M.That healthy gut feeling［J］.Nature，2011，S88-S89.

［5］ Pakkanen R，Aalto J.Growth factors and antimicrobial factors of bovine colostrum［J］.International Dairy Journal，1997，7(5):285-297.

［6］ GB19302-2010.发酵乳［S］.

［7］ Nishino T，Shibahara S H，Kikuchi H，et al.Transit of radical scavenging activity of milk products prepared by maillard reaction and Lactobacillus casei strain Shirota fermentation through the Hamster intestine［J］.Journal of Dairy Science，2000，83(5):911-922.

［8］ 杨洋.如皋长寿村人群肠道乳酸菌益生特性及分子多样性研究［D］.扬州:扬州大学，2010.

［9］ 盛伟，方晓阳，吴萍.白灵菇、杏鲍菇、阿魏菇多糖体外抗氧化活性研究［J］.食品工业科技，2008，29(5):103-106.

［10］ Smirnoff N，Cumbes Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes［J］.Phytochemistry，1989，28(4):1 057-1 060.

［11］ Deeker E A，Weleh B.Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food［J］.Journal of Agricultural and food Chemistry，1990，38(3):674-677.