大黄素对食品模型中晚期糖基化终产物的抑制作用

刘玲，康世墨，张莹，岳璐

(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

美拉德反应是一种广泛存在于食品加工贮藏等过程中的非酶糖基化反应，也称为“非酶褐变”或“羰氨反应”［1］。美拉德反应在高温、室温下均可发生，它不仅与食品的色香味及营养、安全等方面有关，更与人体健康密切相关。食品在进行焙烤、油炸等加工时，美拉德反应末期引发蛋白质交联，生成晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)［2］。研究表明，内源性 AGEs具有体内积聚性，已被证实与许多疾病发生有关，如与糖尿病、动脉硬化等［3］。食源性AGEs是人体AGEs的主要来源，每天AGEs的摄入量大约是25～75 mg，是尿毒症病人血液浓度的10～15倍，只有1/3的食源性AGEs可通过肾脏排出体外，剩余2/3保留在体内，其中大约有1/10参与血液循环［4］。目前对抑制AGEs生成的研究主要集中在医学领域，常用的AGEs抑制剂为氨基胍、ALT 711(4，5-二甲基-3-苯乙酰基噻唑嗡氯化物，DPTC)，但临床试验表明它们对人体具有较大副作用［5］。因此，天然抑制剂的研发已受到科研人员的广泛关注。有相关研究表明，许多具有天然生物活性的多酚类物质，如吡哆胺、黄酮类、杨梅素等可有效抑制体内外AGEs的生成［6-8］。酚类很容易被氧化成醌类，醌类物质亦可以作为AGEs抑制剂，2011年Hiba等［9］人的研究表明，百里香醌对人体内外的AGEs具有很好的抑制作用。

大黄素(1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌)是从天然芦荟、大黄等植物中提取出来的一种蒽醌类活性物质，具有典型的9，10-蒽醌结构，处于最高氧化水平，较为稳定。医学研究表明，大黄素具有抗癌、抗肿瘤、抗炎、抑菌、抗病毒、抗脑缺血损伤、抗氧化、泻下等作用［10］。YAN 等［11］探讨了大黄素对草鱼肝细胞的抗氧化作用，并且具有清除自由基的作用。这些研究主要在医学领域，其对于食品加工过程中糖基化反应的抑制作用未见深入报道。

本文建立赖氨酸-葡萄糖模拟反应体系，以大黄素作为天然抑制剂，通过对糖基化模型体系反应早期、中期和末期各个阶段的产物变化进行分析，探究大黄素对AGEs形成的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-赖氨酸(L-Lys)、葡萄糖(Glc)、NaH2PO4、Na2HPO4、硝基四氮唑蓝(NBT)、盐酸羟胺、乙酸钠、冰乙酸均为分析纯，甲醇、甲酸均为色谱纯，大黄素(98%)购于西安天丰生物科技有限公司。实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;F-4600荧光分光光度计，日本日立公司;D-2000 Elite制备型液相色谱仪，日本Hitachi公司;Prominence LC-20AB高效液相色谱仪，美国惠普公司;DK-S26电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;00000249精密电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 建立Lys-Glc模拟反应体系

将用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)溶解的摩尔浓度比为3∶1的Lys溶液和Glc溶液各取1 mL于具塞试管中，摇匀后，加入同样用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)溶解的20 μmol/L的大黄素溶液1 mL，摇匀并置于70℃的恒温培养箱中培养，以不加抑制剂组作为空白对照。

1.3.2 果糖胺的测定

利用NBT还原法测定果糖胺，用碳酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 10.83)配制0.025 mol/L的NBT(硝基四氮唑蓝)试液。取各组样品溶液1 mL，加入NBT试液4 mL，10%的醋酸溶液终止反应，在530 nm处测其紫外吸光值，不加抑制剂组为对照组，测定0～12 h反应的吸光值。

1.3.3 GO的测定

取各组反应样液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙酸钠溶液(15 g/L)1 mL、盐酸羟胺溶液(2 g/L)2 mL，于50℃恒温水浴中加热20 min，冷却后定容，在233 nm处测其紫外吸光值，不加抑制剂组为对照组，测定0～12 h反应的吸光值。

1.3.4 CML的测定

反应样液经0.45 μm滤膜过滤，取20 μL进样，用峰高表示CML含量。

液相条件:色谱柱:Waters Atlantis T3 C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:V(0.1%甲酸)∶V(甲醇)=70∶30;流动相流速:0.5 mL/min;柱温:25℃;进样量:20 μL;运行时间 10 min。

1.3.5 5-HMF的测定

取各组反应样液0.2 mL于试管中，用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀释至无色后，在284 nm处测其紫外吸光值，不加抑制剂组为对照组，测定0～12 h反应的吸光值。

1.3.6 类黑精的测定

取各组反应样液0.2 mL于试管中，用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀释至无色后，在420 nm处测其紫外吸光值，不加抑制剂组为对照组，测定0～12 h反应的吸光值。

1.3.7 戊糖素的测定

戊糖素具有荧光特性，取各组反应样液0.2 mL于试管中，用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀释至无色后，在在激发波长335 nm、发射波长382 nm处测定其荧光强度，以荧光强度表示AGEs含量，不加抑制剂组为对照组，测定0～6 h反应的荧光强度。

1.3.8 荧光性AGEs的测定

利用AGEs具有荧光性的特性，在激发波长370 nm、发射波长440 nm处有最大吸收峰，取各组反应样液0.2 mL于试管中，用PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀释至无色后，测定其荧光强度，以荧光强度表示AGEs含量，不加抑制剂组为对照组，测定0～12 h反应的荧光强度。

1.3.9 数据处理

采用SPSS17.0软件处理数据，以Origin8.0软件绘图。显著性分析，P＜0.01极显著;P＜0.05显著，试验均进行3次重复。

2 结果与分析

2.1 大黄素对果糖胺生成的抑制作用

果糖胺是美拉德反应初期经羰氨缩合生成的席夫碱再经环化后生成的胺糖。由图1可知，反应1～4 h为果糖胺的大量生成期，在此期间果糖胺的含量随反应时间的延长而增加;4～10 h果糖胺逐步缓慢生成，这是因为部分果糖胺参与到中期反应生成二羰基化合物。加入大黄素后，对早期产物果糖胺的生成起到抑制作用，在反应6h时，抑制率最大，达到26.14%(P ＜0.05)。

图1 大黄素对Lys-Glc体系中果糖胺含量变化的影响Fig.1 Effect of emodin on the content changes of fructosamine in Lys-Glc system

2.2 大黄素对GO生成的抑制作用

GO为非酶糖基化反应的初中期产物，是一种简单的二羰基化合物，利用醛基成肟反应生成的乙二醛二肟的生成量变化反映出GO的含量变化。由图2可知，反应1～6 h GO缓慢生成，在此期间GO的含量随反应时间的延长缓慢增加;6 h后GO大量生成，这是由于一方面果糖胺的参与促进二羰基化合物的大量生成［12］;另一方面，底物葡萄糖自氧化也能够生成GO，所以GO在此阶段大量生成［13］。加入大黄素后，对GO的形成有明显的抑制作用，在反应10 h时，抑制率达到72.22%(P＜0.01)。

图2 大黄素对Lys-Glc体系中乙二醛含量变化的影响Fig.2 Effect ofemodin on the content changes of glyoxal in Lys-Glc system

2.3 大黄素对CML生成的抑制作用

由图3可知，反应1～6 h CML缓慢生成，此阶段主要进行糖基化的初、中期反应，生成大量果糖胺及少量 GO;反应6～10 hCML大量产生，GO参与了CML的生成，CML的产生随GO的增加而显著上升;10 h之后CML含量减少，美拉德反应进入大分子黑色素生成的聚合反应阶段。大黄素对CML的生成有明显的抑制作用，尤其反应中后期CML大量生成，反应10 h时抑制率达到95%(P＜0.01)。

图3 大黄素对Lys-Glc体系中CML含量变化的影响Fig.3 Effect of emodin on the content changes of CML in Lys-Glc system

2.4 大黄素对5-HMF生成的抑制作用

5-HMF是美拉德反应中期Amadori重排产物经烯醇化后脱水形成的醛类化合物，为中期产物生成的另一种途径。由图4可知，5-HMF的生成随反应时间的延长而增大，到4 h后不再增加。大黄素对5-HMF仅在4 h附近有较小的抑制作用。

2.5 大黄素对类黑精生成的抑制作用

类黑精是美拉德反应中期产物与含氮氨基化合物进行醛氨聚合而产生的末期产物，黑褐色，无荧光性。由图5可知，类黑精的生成量随反应时间的延长先缓慢增长，4 h后快速增长，直到反应10 h后开始减少。加入大黄素后，对类黑精有明显的抑制作用，特别是反应6 h时抑制率达68%(P＜0.01)。

图4 大黄素对Lys-Glc体系中5-羟甲基糠醛含量变化的影响Fig.4 Effect of emodin on the content changes of 5-HMF in Lys-Glc system

图5 大黄素对Lys-Glc体系中类黑精含量变化的影响Fig.5 Effect of emodin on the content changes of melanoidions in Lys-Glc system

2.6 大黄素对戊糖素生成的抑制作用

戊糖素是Amadori重排产物经过脱氢、重排、交联等一系列反应，最终生成一种具有荧光性的糖基化终末产物之一。由图6可知，戊糖素的含量随反应时间的延长先增大后减小，最后趋于不变。大黄素自身具有荧光性，但荧光值较低。体系加入大黄素后，对戊糖素没有明显抑制作用，但延缓了戊糖素的生成。

图6 大黄素对Lys-Glc体系中戊糖素含量变化的影响Fig.6 Effect of emodin on the content changes of pentosidine in Lys-Glc system

2.7 大黄素对荧光性AGEs生成的抑制作用

AGEs是一种结构多样的化合物，其中部分AGEs具有荧光性。由图7可知，荧光性AGEs的生成量随反应时间的延长先增后减。加入大黄素后，对反应0～3 h的荧光性AGEs具有明显的抑制作用，特别是反应2 h时，达到最大抑制率为90%(P＜0.01);当反应4 h后，荧光值升高，说明大黄素不再抑制荧光性反应，可见大黄素对戊糖素等荧光性物质的延迟作用，也体现出大黄素对荧光性产物的延迟作用。

图7 大黄素对Lys-Glc体系中荧光性AGEs含量变化的影响Fig.7 Effect of emodin on the content changes of fluorescent AGEs in Lys-Glc system

3 讨论

对于含糖和蛋白的食品，在加工过程中能够生成糖基化产物。加工过程常在高温下进行，由于温度过高导致反应速度过快，常常不利于观察反应各阶段产物的变化，故本研究将模拟体系温度设定为70℃。

大黄素作为一种天然抑制剂添加到非酶糖基化模拟体系中，在反应初期阶段，大黄素对由葡萄糖羰基与赖氨酸氨基缩合环化生成的果糖胺具有抑制作用。果糖胺经Amadori重排后，经烯醇化后再裂解成为二羰基化合物(包括GO、MGO、3-DG、乙二酸等)，进入非酶糖基化的中期阶段，大黄素对GO表现出明显的抑制作用。反应后期，二羰基化合物与氨基化合物醛氨聚合生成末期产物，大黄素对这些产物包括CML、类黑精都有较好的抑制作用。在反应过程中，GO作为CML的前体物质，可经葡萄糖自氧化生成，也可经美拉德反应中间产物氧化生成，因此大黄素抑制糖基化的作用主要体现在抗氧化作用上。大黄素对美拉德反应中间产物5-HMF的生成无明显抑制作用，也说明了大黄素抑制糖基化作用主要表现在抗氧化作用上。大黄素对戊糖素无明显抑制作用，这一结果与梁海燕等人的研究结果相似［14］，可能是由于戊糖素的生成路径与CML有所不同。

4 结论

本研究建立了Lys-Glc模拟食品加工过程中的非酶糖基化反应体系，通过对果糖胺、GO、CML、5-HMF、类黑精、戊糖素、荧光性AGEs的含量变化分析，明确大黄素对非酶糖基化反应的抑制作用。结果表明，大黄素对糖基化反应的氧化产物及进一步生成的中、末期产物具有较好的抑制作用，对具有荧光性的糖基化产物戊糖素和其他荧光性AGEs抑制作用不明显，大黄素的抑制作用主要体现在抗氧化性上。

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