口服酪酸梭菌减轻哮喘小鼠气道炎症的研究

张 娟，魏 春，刘梦昀，黄建琼，吴海霞，郑跃杰，孙 新(第四军医大学西京医院儿科，西安7003;深圳市儿童医院呼吸科;通讯作者，E-mail:sunxin6@fmmu．edu．cn)

支气管哮喘是世界范围内严重威胁公众健康的慢性疾病之一，全球哮喘防治创议(GINA)委员会于2014年对哮喘的定义进行了重要更新，将哮喘定义为:“哮喘是一种以慢性气道炎症为特征的异质性疾病，具有喘息、气促、胸闷和咳嗽的呼吸道症状病史，伴有可变的呼气气流受限，呼吸道症状和强度可随时间而变化”［1］。目前哮喘的发病率和死亡率正在逐年增长，但尚无有效的根治的方法，严重困扰着人类健康。关于哮喘发病机制的探索、哮喘新药的研究与开发、新的治疗方法的评价都依赖于动物实验［2］。目前国内外大多数实验选取BALB/c小鼠建立哮喘模型，主要由于此种小鼠对于IgE介导的变态反应极其敏感［3］。益生菌(probiotics)一词来源于“有益”(pro)和“生命”(bios)，联合国粮食与农业组织/世界卫生组织将其定义为:“当足量补充时，对宿主健康有益的活的微生物”［4］。益生菌的种类很多，常见的有酪酸梭菌、乳酸杆菌及双歧杆菌等。酪酸梭菌是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌，作为微生态制剂有着广泛的临床作用，它不仅可以调理人体胃肠功能，大幅度降低伪膜性肠炎的发病率，而且对于菌群失调引起的腹泻、抗生素相关性肠炎、便秘等都有良好疗效［5］。尽管近年来国内外有很多相关文献报道益生菌对于哮喘等过敏性疾病具有潜在的临床预防和治疗作用。然而，目前关于酪酸梭菌对于哮喘等过敏性疾病的研究却少有报道。本实验旨在通过建立一个稳定的小鼠哮喘模型，探讨酪酸梭菌是否可以通过减少支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及Th2细胞因子、降低血清中卵清蛋白(ovalbumin，OVA)特异性IgE及IgG1水平、改善肺组织病理变化来减轻哮喘小鼠的气道炎症，为哮喘的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物与分组

6周龄清洁级雄性BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心提供)随机分为四组，每组10只，分别为对照组、哮喘模型组、酪酸梭菌预防组和酪酸梭菌治疗组，饲养于第四军医大学基础部动物房，恒定室温(21－25℃)，湿度50%－65%，光照10－12 h/d，不含OVA的饲料进行喂养，整个过程按动物保护和使用指南进行。

1．2 主要试剂及仪器

卵清蛋白 OVA(美国 Sigma公司)，氢氧化铝(天津市天力化学试剂公司)，酪酸梭菌(山东科兴生物制品有限公司)，空压雾化器(欧姆龙大连有限公司)。

1．3 益生菌

酪酸梭菌于－20℃冰箱保存，使用时将其浓度调至5×108CFU/ml，即称取5 g菌粉溶于10 ml生理盐水混匀后分装，－4℃保存。灌胃时每只小鼠200 μl。预防组及治疗组分别于第0－14天和第15－28天采用酪酸梭菌溶液进行灌胃。哮喘模型组于第0－28天采用等量生理盐水代替酪酸梭菌溶液灌胃。

1．4 哮喘模型的建立

动物致敏:除对照组外其余三组小鼠于第7天和第 14 天用 200 μl［100 μg OVA+1．5 mg Al(OH)3］生理盐水溶液进行腹腔注射致敏。对照组小鼠采用仅含有Al(OH)3粉末的生理盐水溶液，注射部位及剂量与实验组相同。

动物激发:用生理盐水配制浓度为1%的OVA溶液作为雾化液。于第21－28天将模型组、预防组及治疗组三组小鼠放在5 L自制的密闭容器中，以雾化液雾化吸入激发，使小鼠暴露在1%OVA气雾中，每日1次，每次30 min。对照组小鼠在相同条件下以生理盐水代替雾化液雾化吸入。

1．5 眼球血的收集及BALF中白细胞计数

在末次激发24 h后取小鼠眼球血后，将小鼠仰卧位固定，暴露气管，用自制穿刺针进行气管插管并固定，用0．8 ml灭菌的冷PBS溶液进行支气管肺泡灌洗，10 s后回抽，重复3次(回抽率 ＞80%)，将回抽的BALF于4℃，2 500 r/min，离心5 min，回收上清置于－20℃保存备用。用1 ml无菌PBS溶液重悬离心后的沉淀，取0．1 ml重悬液进行白细胞计数。

1．6 肺组织病理切片染色

肺泡灌洗完毕后，暴露小鼠胸廓，取小鼠肺组织固定于4 ml 4%多聚甲醛溶液中至少24 h，梯度乙醇脱水后常规石蜡包埋，切片(4 μm)，HE染色后光镜下观察。

1．7 统计学分析

2 结果

2．1 小鼠行为学观察

模型组中大多数小鼠在雾化过程中都出现了烦躁不安，头面部瘙痒，前肢抬缩，弓背抓脸，呼吸急促，腹肌抽搐，大小便失禁及安静少动等哮喘急性发作的症状。对照组、预防组及治疗组小鼠未见明显异常行为。

2．2 各组小鼠BALF中白细胞计数比较

模型组小鼠BALF中白细胞总数明显高于对照组(P＜0．01)，提示哮喘小鼠气道炎症较对照组明显。与模型组相比，预防组及治疗组小鼠BALF中白细胞总数明显降低(P＜0．01，见表1)。

表1 四组BALF中白细胞总数的比较(±s)Table 1 The total white blood cell count in the BALF in four groups(±s)

表1 四组BALF中白细胞总数的比较(±s)Table 1 The total white blood cell count in the BALF in four groups(±s)

与对照组相比，*P＜0．01;与模型组相比，#P＜0．01

组别 n 白细胞总数(105/ml)H P对照组5 0．75 ±0．47 16．374 0．001模型组 6 41．75 ±9．16*预防组 7 1．29 ±0．86#治疗组 7 2．88 ±2．41#

2．3 小鼠肺组织病理变化

空白对照组小鼠病理切片基本正常;哮喘模型组小鼠肺组织病理切片(HE染色)可见小支气管及伴行血管周围有较多的中性粒细胞及吞噬细胞，部分肺泡间隔融合形成肺气肿;预防组及治疗组小鼠肺泡腔中仍可见少量中性粒细胞及吞噬细胞浸润(见图1)。

图1 各组小鼠肺组织病理变化(HE染色，×200)Figure 1 Pathological changes of lung tissues from each group(HE staining，×200)

2．4 BALF中细胞因子的检测结果

与对照组相比，哮喘模型组小鼠 IL-4(P＜0．01)及 IL-13(P ＜0．001)水平明显升高，酪酸梭菌可以明显降低哮喘小鼠IL-4(P＜0．01)及IL-13(P＜0．001)水平(见图2)。BALF中并未测出 IL-10及 INF-γ。

图2 小鼠BALF中IL-4及IL-13的浓度Figure 2 The concentrations of IL-4 and IL-13 in the BALF in four groups

2．5 血清中IL-10的检测结果

与对照组相比，模型组小鼠血中IL-10水平明显降低(P＜0．01)，预防组及治疗组小鼠血中IL-10水平明显升高(P＜0．01，见图3)。

2．6 血清中抗OVA特异性IgE及IgG1水平

与对照组相比，模型组小鼠血中 IgE(P＜0．001)及 IgG1(P ＜0．01)水平显著升高，表明小鼠哮喘模型复制成功。预防组及治疗组较模型组血中IgE(P ＜0．001)及 IgG1(P ＜0．01)的水平明显降低(见图4)。

3 讨论

图3 各组小鼠血清中IL-10的浓度Figure 3 The concentrations of serum IL-10 in four groups

图4 各组小鼠血清抗OVA特异性IgE及IgG1水平Figure 4 The levels of serm OVA specific IgE and IgG1in four groups

支气管哮喘是严重影响公众健康的慢性疾病之一，据估计全球约有3亿哮喘患者，其中我国超过2千万，且儿童哮喘患病率明显高于成人，是致使儿童生活质量下降的主要疾病影响因素［6］。第三次中国城市儿童哮喘流行病学调查显示，我国城市儿童哮喘患病率为 0．48%－7．57%，平均为3．02%，与10年前相比增加了52．8%，且其患病率仍呈明显上升趋势［7］。因此，哮喘的发病机制及防治的研究一直是各国研究的热点。

众多研究表明，体内Th1/Th2比例失调是导致哮喘发病的重要因素，在哮喘发病过程中Th2细胞功能亢进，Th1细胞功能降低［8］。Th2细胞主要产生IL-4、IL-5及IL-13等细胞因子，而Th1细胞主要分泌INF-γ等细胞因子。IL-4、IFN-γ分别是Th2和Th1细胞的特征性细胞因子。IL-4是由Th2细胞产生，其在Th1、Th2细胞调控中起到重要的作用，可促进B细胞增殖及活化，同时能调节抗体同型转换效应，促进IgE、IgG1生成，并具有抑制IgG2a、IgG2b的作用。IFN-γ主要由活化的T细胞及吞噬细胞产生，具有免疫调节作用，并可诱导Th0细胞向Th1细胞转化，抑制Th2细胞生成［9］。起初，IL-10被认定为是一种Th2细胞因子，但进一步研究表明IL-10并不属于Th2或Treg细胞而是一种广泛表达的细胞因子。许多细胞都可以表达 IL-10，例如 Th1、Th2、Th17、Treg、CD8+T 以及 B 细胞［10］。近年来发现IL-10其实是一种具有抗炎作用的细胞因子，由Th细胞分泌，在体内表现出较强的免疫抑制和抗炎效应。调控免疫反应的CD4+CD25+Treg已经成为免疫抑制治疗的焦点，大量相关文献报道 CD4+CD25+Treg可通过分泌细胞因子IL-10等方式抑制免疫反应答，进而使机体产生免疫耐受。另有研究发现，体内IL-10表达减少的小鼠其CD4+CD25+Treg也相应减少，表现出较严重的哮喘炎症反应［11，12］。

本研究发现，与对照组小鼠相比，哮喘组小鼠BALF中炎症细胞总数明显升高(P＜0．01)，IL-4(P ＜0．01)及 IL-13(P ＜0．001)水平显著升高;血清中OVA特异性 IgE(P＜0．001)及 IgG1(P＜0．01)水平也明显升高，IL-10水平却明显降低(P＜0．01)。酪酸梭菌可显著降低哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数(P ＜0．01)、IL-4(P ＜0．01)、IL-13(P ＜0．001)水平，明显降低血清中OVA特异性IgE(P＜0．001)和 IgG1(P ＜0．01)水平，一定程度升高血清中IL-10水平(P＜0．01)。哮喘模型组小鼠肺组织病理切片可见小支气管及伴行血管周围有较多的中性粒细胞及吞噬细胞，部分肺泡间隔融合并形成肺气肿。对照组小鼠病理切片基本正常。预防组及治疗组小鼠局部肺泡腔中仍可见少量中性粒细胞及吞噬细胞浸润。

近年来许多动物实验和临床试验都有类似报道，即益生菌对于哮喘等过敏性疾病具有免疫防治作用。例如，Yu等［13］发现致敏前口服鼠李糖乳杆菌(Lcr35)可以显著减轻哮喘小鼠模型的气道炎症，降低气道高反应性，即Lcr35对小鼠哮喘具有预防作用。Sagar等［14］通过建立小鼠哮喘模型并给予益生菌和激素治疗，发现短双歧杆菌(M-16V)和鼠李糖乳杆菌(NutRes1)具有与布地奈德相似的强烈的抗炎属性，表明益生菌或许可以对儿童哮喘产生重要的治疗作用。近期研究发现哮喘小鼠口服鼠李糖乳杆菌(GG)不仅可以明显降低气道高反应性，显著减少肺泡灌洗液和血清中Th2细胞因子水平，而且还可以明显降低血清中抗OVA特异性IgE水平，减少肺组织中基质金属蛋白酶－9的表达及炎细胞的浸润［15］。van der Aa 等［16］应用合生素(双歧杆菌M-16V、90%短链低聚半乳糖及10%长链果寡糖)进行为期12周的随机对照试验，并对参与者进行了干预后1年的随访，结果显示合生素显著降低了过敏性皮肤炎婴儿的哮喘样症状发病率和哮喘药物使用率。我们的实验结论与这些实验结果相一致。

综上所述，酪酸梭菌可以通过抑制过敏诱导的Th2细胞因子和OVA特异性IgE及IgG1的产生、降低小鼠BALF中炎细胞总数、改善肺部病理变化减轻哮喘小鼠气道炎症。本研究证实酪酸梭菌作为一种常见的益生菌，可能具有防治哮喘的作用，但其临床作用及其机制仍需进一步研究。

［1］Global Initiative for Asthma．Global strategy for asthma management and prevention．http:www．ginasthma．org/local/uploads/files/GINA_Report_2015_Aug11．pdf．

［2］Epstein MM．Are mouse models of allergic asthma useful for testing novel therapeutics［J］．Exp Toxicol Pathol，2006，57(Suppl 2):41－44．

［3］Hsieh KY，Hsu CI，Lin JY，et al．Oral administration of an ediblemushroom-derived protein inhibits the development of food-allergic reactions in mice［J］．Clin Exp Allergy，2003，33(11):1595－1602．

［4］Guarner F，Schaafsma GJ．Probiotics［J］．Int J Food Microbiol，1998，39(3):237－238．

［5］李碧云，傅思武，王金丰．酪酸梭菌的研究进展［J］．中国微生态学杂志，2013，25(1):112－114．

［6］BacharierLB，Boner A，Carlsen KH，et al．Diagnosis and treatment of asthma in childhood:a PRACTALL consensus report［J］．Allergy，2008，63(1):5－34．

［7］全国儿科哮喘协作组．第三次中国城市儿童哮喘流行病学调查［J］．中华儿科杂志，2013，51(10):729－735．

［8］Wegmann M．Th2 cells as targets for therapeutic intervention inallergic bronchial asthma［J］．Expert Rev Mol Diagn，2009，9(1):85－91．

［9］Yuan Y，Yang B，Ye Z，et al．Sceptridium ternatum extractexerts antiasthmatic effects by regulating Th1/Th2 balance and the expression levels of leukotriene receptors ina mouse asthma model［J］．J Ethnopharmacol，2013，49(3):701－716．

［10］LinYL，Liang YC，Tseng YS，et al．An immunomodulatory protein，Ling Zhi-8，induced activation and maturation of human monocyte-derived dendritic cells by the NF-kappaB and MAPK pathways［J］．Leukoc Biol，2009，86(4):877－ 889．

［11］Boonpiyathad S，Pornsurityask P，Buranapraditkun S．Interleukin-2 levels in exhaled breath condensates，asthma severity，and asthma control in nonallergic asthma［J］．Allergy Asthma Proc，2013，34(5):e35－41．

［12］Shasia M，Kanza M，Mehwish I，et al．IL-13 gene poly-morphisms and their association with atopic asthma and rhinitis in Pakistani patients［J］．Iran J Allergy Asthma Immunol，2013，12(4):391－396．

［13］Yu J，Jang SO，Kim BJ，et al．The effects of Lactobacillus rhamnosus on the prevention of asthma in a murine model［J］．Allergy Asthma Immunol Res，2010，2(3):199－205．

［14］Sagar S，Morgan ME，Chen S，et al．Bifidobacterium breve and Lactobacillus rhamnosus treatment is as effective as budesonide at reducing inflammation in a murine model for chronic asthma［J］．Respir Res，2014，15:46．

［15］Wu CT，Chen PJ，Lee YT，et al．Effects of immunomodulatory supplementation with Lactobacillus rhamnosus on airway inflammation in a mouse asthma model［J］．Microbiol Immunol Infect，2014:Epub ahead of print．doi:10．1016/j．jmii．2014．08．001．

［16］van der Aa LB，van Aalderen WM，Heymans HS，et al．Synbiotics prevent asthma-like symptoms in infants with atopic dermatitis［J］．Allergy，2011，66(2):170－177．