间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植延缓骨骼肌萎缩

王丽娟 赵文勇

（1.西南药业股份有限公司，中国 重庆 400038；2.重庆市公安局九龙坡区分局，中国 重庆 400039）

骨骼肌的失神经性萎缩，是周围神经治疗领域至今尚未解决的难题。既往研究表明：神经干细胞直接注射于肌肉内，移植细胞可长期存活，且部分分化为神经元及神经胶质细胞，并有效延缓了失神经性肌肉的萎缩[1-2]，然而足量的神经干细胞获得途径有限且扩增困难，寻找新的移植细胞至关重要[3-4]。新近研究发现，间充质祖细胞具有易获取、易生长、增殖能力强等特点，其体外诱导分化来源的神经元样细胞肌内移植能够原位定植存活及很好地维持移植前神经元及神经胶质样细胞的特性[5-7]。那么将这些神经元样细胞直接移植于靶肌肉内能否达到延缓失神经性骨骼肌萎缩的作用呢？目前国内外文献少见报道。基于此本研究进行了相关探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

GFP 转基因C57 小鼠6 只，雌性，清洁级，3 周龄，质量（10±1）g；C57 小鼠36 只，雄性，清洁级，12 周龄，质量（20±1）g；由中国人民解放军第三军医大学动物中心提供。动物使用许可证：SCXK(渝)2007-0004；环境许可证：XYXK（渝）2007-0004。

1.2 主要试剂

兔抗鼠α-actin、MHC、GAPDH抗体及羊抗兔IgG/TRITC二抗（Sigma公司）；兔抗鼠NSE（neurone specific enolase）、GFAP（glial fibrillary acidic protein）抗体及羊抗兔荧光二抗均购自北京博奥森生物技术有限公司；蛋白提取液（Pierce 公司）；RNAiso Reagent、RNA PCR Kit(AMV)ver.3.0（TaKaRa 公司）；肌细胞生成素扩增引物为5′-TGGAGCTGTATGAGACATCCC-3′，5′-TGGACAATGCTCAGGGGTCCC-3′，磷酸甘油醛脱氢酶扩增引物为5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，MyoD扩增引物为：5′-GCCCGCGCTCCAACTGCTCTGAT-3′，5′-TCTTTTGGGCGTGAAGAACCAG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 GFP-MPC 的分离、培养及鉴定

取GFP 转基因C57 小鼠后肢长骨，MPC 的分离、培养、体外诱导及鉴定方法参考文献[7]。

1.4 小鼠腓肠肌失神经支配模型的制备[8]

C57 小鼠随机分为MPC 移植组、神经断离组及对照组，每组12只。小鼠腓肠肌失神经支配模型制备方法参照文献[6]；对照组不作任何处理。术后2 和4 周，每组随即取6 只小鼠断颈处死并提取双侧小腿腓肠肌作实验观察。

1.5 GFP-MPC 体内移植

选取第3 代GFP-MPC 进行神经元样细胞诱导分化及鉴定后收集细胞，用PBS 调整细胞浓度至5×105/μL。5μL 缓慢散点注于MPC 移植组腓肠肌内，神经断离组对应部位同法注入等量PBS；对照组不作任何处理。

1.6 观察指标

（1）一般情况：观察小鼠后肢活动能力情况。

（2）GFP-MPC 肌内移植存活情况及自身特性的鉴定：切取GFPMPC 注射部位周围肌肉行组织连续冰冻切片，利用GFP 转基因小鼠体细胞自发绿色荧光的特点，荧光显微镜下观察移植细胞存活情况。利用免疫荧光检测神经元特异性标记物NSE，荧光显微镜下观察，以细胞质发出红色荧光者为阳性细胞。

（3）腓肠肌湿重维持率测定：完整切去左右侧腓肠肌称重，右侧除以左侧，计算腓肠肌湿重维持率。

（4）肌纤维横截面积维持率的测定：取小鼠双侧后肢腓肠肌中份肌腹行组织冰冻切片，HE 染色，采用VDSⅢ型半自动图像分析仪（A.M.S 公司）测量肌纤维横截面积（cross section area，CSA），右侧除以左侧，计算其维持率。

（5）超微结构观察：右后肢腓肠肌中份肌腹切取少量组织进行超薄切片，用JEM-12OOEX 透射电镜观察退变的肌细胞核、线粒体、内质网、肌丝肌节的形态及胶原纤维的变化。

（6）Western blot 检测α-actain、MHC 的表达：参照说明书提取肌肉总蛋白质，经过电泳、半干法电转膜及封闭后，兔抗鼠α-actain/MHC、羊抗兔IgG 分别与膜37℃温育，间以洗膜，终以化学发光试剂盒显影、定影及摄片，最后在凝胶成像系统下分析处理，灰度扫描进行半定量分析。

（7）RT-PCR 检测Myogenin、MyoD 的基因表达：参照说明书提取肌肉总RNA 并进行反转录，常规方法进行PCR 及凝胶电泳，最后在紫外透射仪下扫描图像，采用Quantity one 图像分析软件进行半定量分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS 12.0 统计软件包进行分析。数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t 检验。

2 结果

2.1 一般情况

随着治疗时间的延长，MPC 移植组小鼠右后肢活动功能逐渐恢复，术后4 周接近正常。

2.2 GFP-MPC 肌内移植存活情况及自身特性的鉴定

GFP-MPC 移植组注射部位周围腓肠肌可见发绿色荧光的细胞均匀分布于肌纤维间隙，部分细胞伸出轴突样的突起，部分细胞间通过突起互相连接（图1A）；对照组肌内未见确切发绿色荧光的细胞（图1B）。免疫荧光检测发现：GFP-MPC 移植组阳性表达NSE(胞质发出红色荧光)（图1C），而神经断离组对应肌肉组织中无阳性表达细胞（图1D）。这表明MPC 源性神经元样细胞移植于失神经支配靶肌肉中可定植存活，并能够很好地维持移植前自身特性。

图1 移植细胞原位存活情况及神经元特异性标志物的表达情况

2.3 肌肉湿重及肌纤维横截面积维持率变化

术后2 和4 周，MPC 移植组小鼠腓肠肌湿重、肌纤维横截面积维持率均显著高于神经断离组（n=6）（图2）。

图2 肌肉湿重及肌纤维横截面积维持率的变化

2.4 组织学观察

2.4.1 HE 染色

术后4 周，神经断离组骨骼肌细胞胞浆明显固缩，核内移现象普遍，细胞核变性（核染色质异染、缺失、核变小、甚至固缩）增多，染色加深，肌纤维排列紊乱，无方向性，肌纤维直径及横截面积明显缩小，胶原纤维明显增多。GFP-MPC 移植组明显优于神经断离组，与对照组比较，肌纤维排列欠整齐，胞体偏小且大小不一，少量细胞仍可见细胞核变性现象，胶原纤维略有增加（图3 A、B、C）。

2.4.2 超微结构变化

术后4 周，与神经断离组比较，GFP-MPC 移植组细胞核明显增大、核质染色均匀，异染色质发达；线粒体数量增多，肿胀不明显，线粒体脊较多，形状相对正常；内质网扩张少；肌丝肌节排列整齐，横纹清晰，无明显的融合；肌纤维间隙胶原纤维量少；与对照组比较，GFPMPC 移植组细胞核明显增大，核仁增大且明显，异染色质发达，核内移动现象普遍，线粒体数量增多，但肌丝肌节形态偏小(图3 D、E、F)。

图3 治疗对腓肠肌形态学的影响

2.5 肌动蛋白和肌球蛋白的表达

术后4 周，MPC 移植组肌动蛋白、肌球蛋白的表达强度显著高于神经断离组和对照组（n=6）（图4）。

图4 治疗对小鼠肌动蛋白和肌球蛋白的影响

2.6 RT-PCR 检测Myogenin、MyoD 基因表达

术后4 周，MPC 移植组MyoD 的基因表达强度显著高于神经断离组及对照组，Myogenin 基因表达强度显著高于神经断离组；对照组未发现明显Myogenin 基因表达（n=6）（图5）。

图5 治疗对肌肉Myogenin 和MyoD 表达的影响

3 讨论

尽管神经干细胞移植于受损的神经内或注入靶肌肉中均能有效延缓失神经性肌肉的萎缩，但其获得途径有限且扩增困难，因此寻找新的移植细胞仍然至关重要。新近研究发现，间充质祖细胞体外诱导分化来源的神经元及神经胶质样细胞移植于失神经支配靶肌肉中可原位定置存在，并能够很好地表达其移植前自身特性[7]。那么，从理论上推测：将间充质祖细胞源性神经元样细胞直接移植于失神经支配靶肌肉中，亦可能达到延缓骨骼肌萎缩作用，为此，我们进行了该方面研究。

我们研究发现：随着治疗时间的延长，小鼠右后肢活动功能逐渐恢复并接近正常；原位定植存活的移植细胞均匀分布于肌细胞间隙且部分细胞阳性表达神经元特异性标志物（NSE）；肌纤维、肌丝肌节的排列尚整齐且肌细胞核、线粒体、内质网的退变及肌肉纤维化的程度明显优于神经断离组，肌细胞形态与正常对照组较为接近；肌肉湿重、肌纤维横截面积维持率的下降幅度及α-actin、MHC 的降解速度均显著低于神经断离组；这表明间充质祖细胞源性神经元样细胞靶肌内移植可有效延缓失神经性骨骼肌萎缩，其治疗效果与MPC 直接移植于神经离断处较为一致[9]；由于神经损伤，肌肉仍处于失神经支配状态，足量的神经营养作用的丧失致使骨骼肌最终走向萎缩的结局难以改变，但可以有效的为神经再生争取了时间，并可为神经再支配后肌肉功能恢复提供了更好的骨骼肌结构基础。

既往研究表明，肌卫星细胞(muscle satellite cells)是具有增殖和自我更新能力的成肌前体细胞或单能成肌干细胞，这种组织特异的祖细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起着重要的作用[10]，但肌卫星细胞的激活和成肌分化受MyoD 家族的bHLH 转录因子调控，其中MyoD 决定着肌卫星细胞是否能激活成为具有成肌特性的肌肉干细胞，而Myogenin 则发挥着调节肌肉干细胞终末分化为肌管肌纤维的功能[11]。此外，大量动物实验发现：成体骨骼肌一旦失神经支配，所有成肌调节因子的表达均上调，尤其是Myogenin 的高表达可启动一系列骨骼肌特异的胚胎性受体和收缩蛋白的合成，而这些胚胎性蛋白的表达是失神经骨骼肌接受神经再支配的必要前提[12]。本实验研究发现，术后4 周，MPC 移植组MyoD 表达强度显著高于神经断离组和对照组，Myogenin 基因表达强度显著高于神经断离组，对照组未发现Myogenin基因明显表达。因此，推测间充质祖细胞源性神经元样细胞肌内移植延缓骨骼肌萎缩的可能机制是：定植存活的神经元样细胞分泌了骨骼肌所必需的某些神经营养因子，致使处于静止状态的肌卫星细胞被激活并成肌分化产生大量的新生肌纤维抑或直接抑制了肌细胞的萎缩，进而肌肉湿重、肌肉蛋白含量及肌纤维横截面积得以维持，但其具体作用机制仍有待进一步实验研究。

［1］Yasuhara T，Matsukawa N，Hara K，et al.Transplantation of human neural stem cells exerts neuroprotection in a rat model of Parkinson’s disease[J].Neurosci，2006，26(48)：12497-12511.5 Kim SU.Genetically engineered human neural stem cells for brain repair in neurological diseases.Brain Dev，2007，29(4)：193-201.

［2］沈云东，徐建光，徐文东，等.神经干细胞移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2008，22(90)：1051-1055.

［3］Belegu V，Oudega M，Gary D S，et al.Restoring function after spinal cord injury：promoting sponatneous regneration with stem cells and activity based therapies[J].Neurosurg Clin NAm，2007，18(1)：143-168.

［4］Faijerson J，Tinstey R B，Aprico K，et al.Reactive astrogliosis induces astrocytic differentiation of adult neural stem/progenitor cells vitro[J].Neurosci Ras，2006，84(7)：1415-1424.

［5］Choi CB，Cho YK，Prakash KV，et a1.Analysis of neuron—like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys Ras Commun，2006，350(1)：138-146.

［6］杨里，万立华，粟永萍，等.小鼠间充质祖细胞向神经元样细胞诱导分化的实验研究[J].重庆医科大学学报，2010，35(06)：801-804.

［7］赵文勇，万立华，粟永萍.间充质祖细胞源性的神经元样细胞肌内移植后自身特性维持[J].第三军医大学学报，2013，35(8)：744-749.

［8］赵文勇，王涛，王军平，等.肌肉特异性microRNAs 在失神经肌肉萎缩中表达变化的研究[J].第三军医大学学报，2008，30(21)：2034-2036.

［9］赵文勇，万立华，粟永萍，等.神经断离处移植间充质祖细胞延缓骨骼肌萎缩[J].基础医学与临床，2013，33(8)：971-975.

［10］Gussoni E，Soneoka Y，Strickland CD，et al.Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation[J].Nature，1999，401：390-394.

［11］Arnold HH，Winter B.Muscle differentiation：more complexity to the network of myogenic regulators[J].Curr Opin Genet Dev.，1998，8：539-544.

［12］Adams L，Carlson BM，Henderson L.Adaption of nicotinic acetylcholine receptor，Myogenin，and MRF4 gene expression to long-term muscle denervation[J].J Cell Biol.，1995，131：1341-1349.