补充葡萄糖或低聚糖对动情周期抑制大鼠瘦素水平的影响

李 合 ，王人卫 ，赵 璨 ，王超宇 ，刘晓丽 ，洪润肖

运动性月经周期紊乱是女性特殊的医学问题，对女性的身心健康均有不利影响。调查研究发现，优秀长跑运动员的运动性闭经的发病率高达40%～50%[1]，大学生运动员运动性闭经的发病率也高达31%[2]，参与休闲体育活动的女性月经周期紊乱发生率也普遍偏高，而普通女性月经周期紊乱发生率仅为2%～5%[3]。运动性月经周期紊乱起始于下丘脑功能紊乱，其促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲性释放的情况直接关系到性腺轴调节的正常与否。研究发现，下丘脑GnRH脉冲性释放与瘦素（leptin）密切相关，下丘脑GnRH脉冲的释放需葡萄糖氧化供能，葡萄糖进入下丘脑是依赖于leptin的介导[4-6]，当leptin水平较低时，下丘脑就因无足够的葡萄糖供能而引起GnRH释放失调。大负荷运动的女性和能量摄入受到限制或不足的女性，血液中leptin的浓度均降低。

近年越来越多的动物和人类模型的研究资料都支持能量摄入不足而导致慢性能量负平衡[7]。但是，有关增加外源性可利用能量对leptin水平影响的研究却鲜有报道。因此，本研究在不改变大鼠运动负荷、不使用药物干预的情况下，参照王人卫等建立动情周期 （又名发情周期，是雌性哺乳类动物拥有的一种生理性变化，类似人类月经周期）抑制模型的方法[8]，即表现为阴道脱落细胞中、底层有核上皮细胞增多。通过6周的递增负荷训练建立动情周期抑制模型后，再进行3周恒定负荷训练（以维持动情周期抑制状态），同时采取不同的干预措施。观察在仅以补糖方式提供外源性可利用能量的情况下，动情周期抑制大鼠的动情周期恢复和血清leptin水平的改变情况，探讨能否通过补充外源性能量改善leptin水平，进而促进动情周期抑制的缓解，并进一步分析哪种补糖效果较好。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选取健康成熟2月龄雌性SD大鼠45只，由上海实验动物资源中心西普尔—必凯实验动物有限公司提供，生产许可证号是SCXK（沪）2008-0016，利用符合国家饲料卫生标准的啮齿类动物饲料 （由上海仕林生物科技有限公司提供，产品标准编号：Q/TJCX 1-2007），作为基础标准饲料（1337KJ/100g）。干预所用的葡萄糖和低聚糖由河北华辰淀粉糖有限公司提供，生产许可证号是QS130123010057，质量管理体系认证证书编号为：00109Q23299R0M/1300。大鼠随机分笼，每笼3只，自由饮食和饮水。室温20～25℃，相对湿度55%～60%，每天光照12 h，从上午9:00至晚上21:00。本实验设计通过上海市营养学会医学伦理委员会的鉴定并接受其监督 （上海市营养学会医学伦理委员会 [伦审]2013-002）。

1.2 研究方法

1.2.1 分组方法

45只2月龄SD雌性大鼠在适应运动两周后，随机分为5组，每组9只。分为对照组C组，该组不进行运动训练；模型中组M组，该组进行9周运动训练，前6周为递增负荷训练，后3周为恒定负荷训练。实验干预组分为3组，前6周为递增负荷训练，后3周采取不同的干预方式，其中后3周安静休息的为R组；继续进行3周恒定负荷训练，并进行葡萄糖补充的为G组；继续进行3周恒定负荷训练，并进行低聚糖补充的为O组（见图1）。实验组的运动负荷方案同阳性对照组M组一致，后3周的恒定负荷采用的是第6周递增负荷训练的方案。

图1 实验设计Figure1 Experiment Design

1.2.2 干预方法

本实验模拟田径运动中周期性耐力跑的形式，参照Bedford动物运动负荷标准[9]。每周训练6 d，休息 1 d，每天训练两次，上下午各训练一次，第9周最后一天晚上再加训一次。在大鼠处死前安静休息36 h，以消除运动应激产生的影响，并禁食12 h。

对照组和实验组前6周均采用普食喂养，且均饮用纯净水；后3周实验组的G组和O组在普食喂养的基础上，每天称取 24 g葡萄糖（17.2 kJ/g）或低聚糖(17.2 kJ/g)，溶于200 ml温水中，搅拌溶解后，供大鼠饮用，其余组仍饮用纯净水和普食喂养。

1.2.3 取材

大鼠称重后，按40 mg/kg大鼠体重计算麻醉剂 （浓度10%水合氯醛）量，5min大鼠麻醉后，测量大鼠体长。将大鼠四肢固定在手术台上，迅速打开腹腔，剥离下腔静脉，用一次性负压真空管采血5～8 ml后，取出腹壁、肾周围及生殖器周围脂肪等内脏器官处的白色脂肪组织，并利用FA-2004型电子天平称重并进行记录。血液样本在低温离心（3000r/min）15 min后，取上清液测定雌激素、孕酮和瘦素。

1.2.4 指标检测

雌二醇（E2）的测定使用免疫化学发光法，采用Beckman Coulter公司生产的 Access 2 immunoassay system （全自动化学发光免疫测定系统）测定，试剂盒由Beckman Coulter公司提供。孕酮（P）的测定使用双抗体放射免疫分析法，γ记数仪采用中科院上海原子能所日环仪器厂所生产的（型号为SN695B型智能型）；孵育箱采用的是青岛海尔公司生产的；移液器采用法国吉尔森Gilson公司生产的。瘦素（Leptin）的测定采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA），采用 Thermo生产的酶标仪测定（型号为MK3），试剂盒由美国R&D公司提供。

1.2.5 数据处理

采用spss20.0数据软件包对数据进行分析处理，所得结果均以均值±标准差表示。组间差异采用单因变量方差分析进行分析，两两比较采用Tukey法分析。P<0.05，具有显著性差异。

2 研究结果

2.1 体重及内脏脂肪含量的变化

由表1可见，各组大鼠体重在6周递增运动负荷未采取恢复措施前，体重变化基本同C组一致，但自第七周开始，不同组别体重的变化趋势开始不同，R组体重自第七周开始迅速增长，M组体重基本不再变化，而O、G组也呈增长趋势，但无R组明显。

各组大鼠实验前体重无显著性差异（表2），但经过运动训练和不同干预措施后，实验结束后体重有显著性差异。干预组中，除R组显著高于C组外，G组和O组均显著低于C组；而干预组各组均显著高于M组。干预组各组间比较发现，R组均显著高G组和O组，而G组和O组间无显著性差异。

将大鼠体长、体重作为随机变量，利用协方差统计发现（表3），M组的内脏脂肪含量显著低于阴性对照组C组。而经过3周的干预，实验干预组各组的内脏脂肪含量均显著高于M组，且R组的内脏脂肪含量同C组相比较，无统计学差异；G组的内脏脂肪含量同O组也无统计学差异。

2.2 血清leptin浓度的变化

表4为大鼠血清leptin浓度的变化，由表可见，M组的血清leptin浓度显著低于其余4组。O组的血清leptin浓度显著低于C组，而R组和G组的血清leptin浓度同C组无显著性差异。O组、R组和G组之间血清leptin浓度无显著性差异。

表4 各组大鼠血清leptin浓度的变化情况 (单位：μg/L)Table Ⅳ Serum Leptin Concentration Changes of the Different Group Rats(ug/L)

2.3 雌激素和孕激素的变化

由表5可见，各组大鼠血清E2存在显著性差异。同C组相比较，只有M组大鼠血清E2浓度显著低于C组,而其余组与C组相比，均无显著性差异。R组和O组大鼠血清E2浓度显著高于M组，而G组血清E2浓度与M组相比无显著性差异。R组、O组及G组之间大鼠血清E2浓度无显著性差异。

表5 各组大鼠血清E2浓度的变化情况 (单位：pg/ml)Table Ⅴ Serum E2Concentration Changes of the Different Group Rats(pg/ml)

由表6可见，各组大鼠血清P浓度存在显著性差异。M组的血清P浓度显著低于其余4组，而其余4组之间并无显著性差异。

表6 各组大鼠血清P浓度的变化情况（单位：pg/ml）Table Ⅵ Serum P Concentration Changes of the Different Group Rats(pg/ml)

3 讨论与分析

内脏脂肪具有缓冲震荡、保护内脏器官，又具有提供能量、维持机体生命需要的作用。在外源性能量不足以维持运动和基本生理消耗时，内脏脂肪则成为主要的供能物质。研究发现，运动性月经周期紊乱发生的主要原因在于机体可利用能量的不足[10]，作为机体能量的存储器，内脏脂肪对维持月经周期正常具有重要作用。研究报道，普通大学生内脏脂肪含量高于体育专业女生含量，而体育专业女生月经失调的比例远高于普通大学生[11]。女性运动员在长期可利用能量不足的情况下，机体动员内脏脂肪分解，导致内脏脂肪含量下降，运动性月经周期紊乱发生比例升高。由本研究可见，通过安静休息、补充低聚糖或葡萄糖，均减少了内脏脂肪的消耗。

近年研究发现，内脏脂肪除上述功能外，还能够以自分泌、旁分泌、远距分泌的方式产生生物活性因子，具有免疫、调节机体能量平衡、影响生殖功能等作用。因此，内脏脂肪不仅具有储存能量作用，也有“内分泌器官”的分泌功能。leptin是由脂肪细胞分泌的一种多肽类激素，与其受体结合后，具有抑制食欲、减少能量摄入、增加能量消耗等多种生物学效应。研究发现，对小鼠脑室注射leptin后减少了食物的摄取，导致体重的下降，表明leptin能直接作用于中枢神经系统的leptin受体，传达给中枢神经系统机体能量储存信号[12-14]。人在进入青春期后，血清中leptin的水平显著升高，并且女性的leptin水平通常是男生的2～3倍[15]。离体的实验研究表明，leptin能够直接作用于下丘脑和脑垂体，刺激GnRH和LH的释放[16]。循环血液中leptin水平通常与体内储存的脂肪量保持在一定比例，一定量的leptin进入大脑，通过与下丘脑内的leptin受体结合控制食物的摄取和能量的消耗[4]。循环血清中的leptin水平反映了脂肪储存的能量以及在能量摄入时的急剧变化[16]，进行剧烈运动的大鼠和能量摄入受到限制或不足的女性，循环血液中的leptin水平减少并伴有内分泌异常，对性腺轴和甲状腺轴有较大的影响。下丘脑GnRH脉冲性释放与leptin密切相关，研究发现下丘脑GnRH脉冲的释放需葡萄糖氧化供能，葡萄糖进入下丘脑是依赖于leptin的介导[4]，所以当leptin水平较低时，下丘脑因无足够的葡糖糖供能而引起GnRH释放的紊乱。因此，当内脏脂肪过度消耗时，leptin的分泌受到影响，直接影响哺乳动物的生殖功能[17]，导致闭经的发生。

本研究发现，模型组的leptin水平显著低于对照组。采用安静休息、补充低聚糖和葡萄糖等干预措施组的lep tin水平均较模型组显著升高，表明通过安静休息或补糖干预，能有效减缓leptin水平下降。同时，伴随血清leptin浓度的升高，安静休息组、补充低聚糖组和补充葡萄糖组大鼠的血清E2、P浓度也升高，表明大鼠动情周期抑制逐步缓解。

4 结论

通过对动情周期抑制大鼠补充葡萄糖或低聚糖，增加了内脏脂肪含量，促进了瘦素的分泌和雌激素、孕激素的合成，有效缓解大鼠的动情周期抑制。补充两种糖之间的效果无显著性差异。

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