过热蒸汽膨化青苹果组织结构的定量分析

郭 瑞，安凤平，宋洪波，仇东朝，张伙平，吴枭锜

(福建农林大学食品科学学院，福建福州350002)

果蔬在加工的过程中，由于受热、压力、化学变化等效应的影响，宏观上，物料会发生皱缩、膨胀、变形等变化;微观上，物料细胞内、外空间的大小会发生改变[1－3].青苹果等植物物料是由无数形态、大小和排列方式不同的细胞及细胞外空间组成的天然多孔性材料[4]，在过热蒸汽膨化的过程中，细胞的内、外空间均会发生变化.细胞内、外空间的变化正是引起物料宏观结构改变的内因，研究膨化青苹果的细胞结构是探索基于细胞水平的果蔬组织性状与膨化等因素关系的基础.

图像处理技术一般分为模拟图像处理和计算机图像处理两大类[5].随着微观细胞理论的发展，计算机图像处理技术应用于植物物料的细胞结构分析，为从细胞水平上阐释加工物料前后宏观特性变化的原因提供了途径[6－7].细胞图像定量分析的关键步骤是图像分割，图像分割技术在工业自动化、生物特征识别、交通控制系统以及医学影像分析等方面得到了广泛的应用[8－10].目前关于植物物料细胞特征的定量分析研究尚未见报道.

通过定量计算植物物料细胞内、外空间的二维特征，有利于从微观层面揭示过热蒸汽膨化等加工因素及条件与产品组织特征的关系，也可为定量评价加工参数与物料组织变化的关系提供理论和方法依据，具有广泛的科学和实践指导意义.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 青苹果，福州市售，平均含水率86.2%(湿基).

1.1.2 试剂 亚硫酸钠为国药集团化学试剂有限公司产品.

1.1.3 设备与仪器 设备与仪器有试验型过热蒸汽膨化机(自制)、DHG-9003A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)、BSA124S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、XL-30型扫描电子显微镜(荷兰PHILIPS公司).

1.1.4 图像处理软件 软件有 Photoshop 7.0、Digital Image Tool 3.0、MATLAB R2010b.

1.2 方法

1.2.1 样品制备 步骤:青苹果(初始含水率86.3% )→清洗→去皮、去 核→切块(20 mm×20 mm×12 mm )→护色[11]→预干燥(70℃)至物料含水率为 2 0%→过热蒸汽膨化(过热蒸汽温度122℃、膨化压差0.3 Pa、膨化时间41 s)[12]→后期干燥(70℃)至含水率为5%→样品.

1.2.2 电镜图片的制备 挑选膨化效果好的样品进行切样.用不锈钢超薄刀片从上往下迅速纵切样品，选取切面(厚度不超过2 mm)平整、厚薄均匀的样片供电镜扫描.切样时注意不可破坏样品的组织结构，需保证切面平整.将样片用双面胶带纸固定在样品台上，喷镀导电层，送入观察室，抽真空，进行图像制备.

图1 细胞数量统计模型示意图Fig.1 The model for quantity statistics of cells

1.2.3 细胞计数 植物物料的电镜扫描图像为二维图像.由于青苹果的细胞多以近球形为主，因此，图像显示的细胞形状为近圆形.电镜图像成像时，视野中包括完整和非完整的细胞.细胞数量统计模型示意图如图1所示.

细胞计数时，面积小于1/2的细胞个数不计;面积大于1/2的细胞按1个完整细胞计;面积约等于1/2的细胞按0.5个细胞计.由于成像时上述各类情况出现的概率均等，因此这种细胞计数方法可以较近似地计算出图像中的细胞个数.

1.2.4 细胞内、外二维空间的特征模型 电镜图片经过图像处理可以计算出二维图像的总面积S、细胞面积(即细胞内空间面积)Ss、细胞外空间面积Sm和细胞个数n，则:

细胞内、外空间面积比值γ是反映物料加工过程中微观组织变化的重要特征参数之一，表达式如下:

单个细胞的当量直径ds与其平均面积的关系为:

2 结果与分析

2.1 图像的预处理

过热蒸汽膨化青苹果的扫描电镜图像如图2所示，该图像是以加速电压为20.0 kV、放大倍数为100倍的条件下拍摄的.由于细胞内、外区域的对比度不大，因此首先需要进行涂色以增加对比度，才能满足图像识别的基本要求.涂色后的组织图像如图3所示.

图2 扫描电镜图像(×100)Fig.2 The electron microscopy original image(×100)

图3 涂色后的组织图像(×100)Fig.3 The image after coloring(×100)

2.2 图像去噪声

去除图像噪声的目的是消除图像数据中的噪声，提高图像质量，增强纹理效果，突出图像所要研究的主体部分[13].其方法主要包括灰度变换增强和滤波去噪.常见的灰度变换函数有线性函数、对数函数等[14]，两种方法虽然都能在一定程度上达到增强图像的目的，但分段线性变换需要更多的用户输入，这会增加图像处理的工作量.因此本试验采用对数变换的方法增强图像的对比度[15].常见的空间域上的滤波算法有平滑线性滤波、中值滤波等[16]，中值滤波与平滑线性滤波相比，对脉冲干扰及椒盐噪声的抑制效果好，同时能有效保护边缘信息的模糊[17].因此，本试验确定采用中值滤波来去除图像中的噪声.借助MATLAB工具箱中对数函数和rab2gray函数对图3进行处理.去噪声处理(对数变换、3*3模板中值滤波)后的组织图像如图4所示.

2.3 图像分割

图像分割是从图像中分离出所需要的区域，以便识别和分析，常见的图像分割方法分为基于边缘检测方法和阈值化分割方法两种[18].组织图像的细胞边缘是图像最基本的特征，它是由灰度不连续性所反映的，边缘两侧具有不同的纹理特征，边缘处像素灰度值具有方向性[19－20].经典的边缘提取方法是考察图像的每个像素在某个邻域内灰度的变化，利用边缘邻近一阶或二阶方向导数变化规律，用相对简单的方法检测边缘.其中比较常用的边缘检测算子有罗伯特算子、索贝尔算子、普瑞维特算子、拉普拉斯算子和坎尼算子[21].由于细胞边缘并非连续光滑的，因此若采用基于边缘检测方法会产生较大的偏差.

阈值分割是利用图像中要提取的目标物与其背景在灰度特性上的差异，把图像分为具有不同灰度级的两类区域(目标和背景)[22]，因此更适合组织的细胞特征提取与计算.选取一个合适的阈值T，以确定图像中每一个像素点应该属于目标还是背景区域，从而产生相应的二值图像.所有灰度值小于(或大于)某一阈值的像素均属于目标，而灰度值大于等于(或小于等于)该阈值的像素组成背景.设输入图像信号为f(x，y)，输出信号为g(x，y)，则二者之间存在下列关系:

图4 去噪声后的组织图像Fig.4 Tissue image after removing noise

式(5)中的I1和I2分别对应分割后图像目标和背景区域的灰度值，因此二者不相等，通常取I1=0，I2=1.因此，阈值化的输出结果为二值图像，一般灰度级0表示目标，灰度级1表示背景.

图像的直方图可看成像素灰度值的概率分布密度函数的一个近似，设一幅图像仅包含两类主要的灰度值区域(目标和背景)，那么其直方图所代表的像素灰度值概率密度分布函数实际上就是对应目标和背景的两个单峰分布密度函数之和[23].去噪声后的灰度图像直方图(图5)具有明显的双峰，谷的跨度较大，容易找到分割阈值.

图5 去噪声后的灰度图像及其直方图Fig.5 Grayscale images after removing noise and its histograms

根据预处理后组织结构直方图的特点，分别选取谷底灰度值10、50、90、130、170等5个阈值对图像进行分割.在MATLAB图像处理工具箱中im2bw函数可用于实现直方图阈值分割[24].不同阈值的直方图阈值分割效果如图6所示.

由图6可知:阈值选取过小(10)时会造成过度分割，分割得到的细胞边缘毛刺过多;阈值过大(170)时，细胞外空间的纹理也被分割出来;阈值选在50、90、130时，都能够有效分割出组织细胞;阈值选在两峰正中间的谷底所对应的灰度值，即90附近时，分割效果最佳.

图6 不同阈值的直方图阈值分割效果Fig.6 Segmentation results of different threshold histogram

2.4 特征提取

组织结构图像经过阈值为90的直方图阈值分割后，细胞内、外空间区域实现了有效分离.对得到的二值图像进行取反操作(MATLB软件中bw1=～bw操作)，结果如图7所示.取反后，细胞内空间的灰度值为1，细胞外空间的灰度值为0，这有利于提取图像的细胞特征.

2.4.1 细胞计数 由于组织图像的细胞区域像素是连续的，在二值图像中表现为连通性，因此可以利用计算连通区域的数量来计算细胞数量[24].在MATLAB软件中利用bwlabel函数可以求出连通区域的数量，并可为细胞区域依次标号.细胞计数情况如图8所示.

图7 取反后的二值图像Fig.7 Binary image after inverting

图8 细胞计数Fig.8 Results of cells counting

程序自动计数的结果为72个细胞，这包含了边缘不完整的细胞个数.根据“1.2.3”中提到的细胞计数方法，图8中面积小于1/2的细胞有11个可忽略不计，面积约等于1/2的细胞有4个按2个计，其余细胞按完整细胞统计个数.因此，细胞计数结果为59个.

2.4.2 细胞特征的提取 二维图像的特征分为统计特征和视觉特征两类[25].统计特征是指图像的直方图、矩、频谱等抽象特征，通过变换才能得到;视觉特征是指人的视觉可直接感受到的自然特征，如区域的轮廓、面积或纹理等.组织细胞图像的特征更适宜以视觉特征加以表达，更易反映物料在加工过程中组织细胞的变化情况，因此，本试验把视觉特征作为主要研究对象.在MATLAB软件平台下，借助图像处理工具箱中的regionprops(L，properties)函数进行编程处理.针对本试验可获得以下细胞形状特征信息:

周长:细胞区域的轮廓长度，即细胞区域轮廓线的像素个数;

面积:细胞区域像素个数;

当量直径:与细胞区域有相同面积的圆的直径;

圆度:用来表示细胞形状的复杂程度，表达式为:R=4πA/P2，式中，A表示面积，P表示周长;

紧凑度:指细胞当量直径与其长轴的比值.

过热蒸汽膨化青苹果组织图像的细胞形状特征分布如图9所示.图9只统计了完整显示的细胞，可以看到图像中各个细胞的周长、面积和当量直径的分布范围很大，比较松散，表明过热蒸汽膨化组织细胞大小差异较大;而各个细胞的紧凑度和圆度分布范围很小，较集中，表明不同细胞的形状差异相对较小.

图9 细胞形状特征的分布图Fig.9 Distribution diagram of cells shape characteristics

2.4.3 细胞内、外的二维空间 利用Digital Image Tool 3.0软件测定出处理的青苹果组织细胞图像的大小为712像素×421像素，即图像总像素值为299752.图像中组织细胞的面积即取反后图像灰度值为1的区域像素总和，细胞外区域面积即图像总像素值与细胞区域像素总和之差.细胞个数按59个计，结合式(1)－(4)，可得到组织细胞内、外空间的二维特性参数，结果如表1所示.

表1 细胞内、外空间的二维特性模型参数Table 1 The two-dimensional space model parameters of cells inside and outside

3 结论

(1)以过热蒸汽膨化青苹果的扫描电镜图像为研究对象，通过对图像涂色以增强了图像的对比度，用中值滤波(3*3模板)作为图像去噪方法，采用阈值为90的直方图阈值分割后，细胞内、外空间区域实现了有效分离.

(2)提取了分割后二值图像的细胞周长、面积、当量直径、圆度和紧凑度等5个形状特征参数，统计分布情况显示:细胞面积、周长和当量直径的分布比较松散，表明过热蒸汽膨化的青苹果的细胞大小差异较大;紧凑度和圆度分布较集中，表明不同细胞的形状差异相对较小.计算过热蒸汽膨化青苹果电镜图像的细胞内、外面积比为0.874，表明细胞内空间所占的比例较大.本试验确立的定量分析过热蒸汽膨化物料组织结构方法适合细胞近似球形的各种物料，应用比较广泛，对于未来研究基于微观揭示过热蒸汽膨化机理起到指导意义.

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