番鸭源小鹅瘟病毒和番鸭细小病毒的结构蛋白及其抗原性

刘 伟，程晓霞，陈少莺

(1.福建农林大学动物科学学院，福建福州350002;2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013)

鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus，MDPV)，均属于细小病毒科细小病毒属的成员，基因组大小约5000 bp，病毒粒子直径20-22 nm，无囊膜，呈二十面体对称[1-3].GPV和MDPV基因组均包括两个开放阅读框(open read flame，ORF)，左侧ORF编码非结构蛋白NS1和NS2，具有相同的终止密码子;右侧ORF编码结构蛋白VP1、VP2和VP3，其中，VP1蛋白包含了VP2和VP3蛋白，并使用同一终止密码子[4-5].

VP基因主要编码病毒粒子的衣壳蛋白，不仅能诱导机体产生抗体的成分，还可能与病毒的毒力及致病性有关[6-7].程由铨等[3]研究表明，MDPV 和番鸭源小鹅瘟病毒(goose parvovirus from muscovy duck，MDGPV)在病毒结构、基因组大小和理化特性等方面极为相似，但二者致病性明显不同.王劭等[8]对MDGPV PT株基因的序列分析发现:其VP基因兼有GPV和MDPV的结构蛋白基因特征，即在VP1基因独特区具有MDPV核苷酸序列特征，而VP2基因具有GPV核苷酸序列特征;VP2和VP3基因在核苷酸和氨基酸水平上，MDGPV PT株与GPV的同源性都高于其与MDPV F株的同源性.Wang et al[9]通过中和试验发现，MDPV和MDGPV对同源血清的中和抗体效价明显高于对异源血清的效价，但这种差异与哪种结构蛋白有关，尚不清楚.为此，本试验应用免疫印迹方法，分析比较二者结构蛋白的抗原性差异.

1 材料与方法

1.1 病毒株、血清和主要试剂

MDGPV PT株和MDPV P株及番鸭抗MDGPV高免血清(G1)、番鸭抗MDPV高免血清(M1)和不同抗体水平的番鸭血清，均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒研究室提供.羊抗鸭IgG-HRP购自美国KPL公司;预染蛋白质Marker(6-175 ku)、NC膜、脱脂奶粉和DAB显色液均购自武汉博士德生物工程有限公司.

1.2 病毒的增殖与纯化

分别将MDGPV PT株和MDPV P株经尿囊腔接种到12日龄番鸭胚中，每枚0.1 mL，于37℃培养.每天照胚2次，弃去24 h内的死胚，收获48-120 h死亡的含毒胚液，于3000×g离心30 min，取上清液于40000×g离心90 min，弃上清液;沉淀重悬于少量0.01 mol·L-1PBS(pH 7.2)中.加入等量氯仿，强力振摇15 min，于2500 r·min-1离心20 min;重复抽提一次，过4B柱纯化，用紫外吸收法调整蛋白含量至10 mg·mL-1，即为纯化病毒样品.

1.3 MDGPV和MDPV血清的制备

MDGPV和MDPV血清分为免疫番鸭血清和攻毒耐过番鸭血清，均购自福州山区(非疫区)健康番鸭场.免疫番鸭血清采自1-2日龄雏番鸭，将全细胞MDGPV和MDPV抗原与弗氏佐剂乳化均匀，免疫后采血制备血清(G1和M1).接种MDPV和MDGPV二联疫苗免疫鸭血清(E1和E2).MDGPV攻毒番鸭7日龄后采血.其中，攻毒5 d后采血的编号分别为6118、6125、6112和6115;攻毒10 d后采血的编号分别为6117、6124、6125和6119;攻毒15 d后采血的编号分别为6106、6113、6136和6120.经过试验测定抗体水平后备用.

1.4 MDGPV和MDPV血清抗体效价的测定

按程由铨等[10]的方法进行.在96孔板中，每排第一孔每孔加入50 μL 4 U凝集抗原;第二孔后每孔加入50 μL 2 U凝集抗原.然后在第一孔中加入50 μL待检血清，做连续倍比稀释后，置37℃摇水浴箱中孵育30 min.每孔取10 μL抗原抗体混合液与等量的致敏乳胶混合，置37℃摇水浴箱中孵育20 min，观察结果，以能完全抑制乳胶凝集的最高稀释倍数为该血清的乳胶凝集抑制试验(latex agglutination inhibition test，LPAI)效价.

1.5 免疫印迹试验

1.5.1 SDS-PAGE电泳 配制12%分离胶和5%浓缩胶，胶厚1.5 mm.将纯化病毒分别与2×样品缓冲液等量混合，于100 ℃水浴10 min，上样(15 μL·孔-1，即30 μg·孔-1).电泳条件:浓缩胶电压80 V，分离胶电压110 V.电泳至溴酚蓝距凝胶底部1 cm左右时停止，取下其中一块凝胶(另一块供电转移)，转入5倍体积的考马斯亮蓝染色液中，染色4 h以上，用脱色液脱色.

1.5.2 电转移 电泳完毕后，取出其中一块凝胶浸入转移缓冲液，置4℃平衡15-20 min后，以“滤纸→凝胶 NC 膜→滤纸”的顺序，胶负极膜正极方向接通电源，以16 V、90 min进行电转移.

1.5.3 免疫印迹分析 电转移结束后将NC膜取出，置封闭液(5%脱脂奶粉)中，于4℃过夜;弃去封闭液，用5%脱脂奶粉洗膜3次，每次5-10 min;加一抗(1∶100稀释的番鸭血清)，于37℃摇床温和摇动2 h;弃去一抗，用上述方法洗涤3次;加二抗(羊抗鸭IgG，工作浓度1∶400)，于37℃摇床温和摇动2 h，用上述方法洗涤3次;加DAB显色液，避光显色，当有清晰条带出现时水洗终止反应，拍照保存.

2 结果与分析

2.1 特异性抗血清的LPAI效价

LPAI效价测定结果(表1)显示:高免血清G1和M1的LPAI效价均达212;二联疫苗血清E1和E2的LPAI效价达26-27;LPAI效价达25以上的MDGPV番鸭血清有12份.

2.2 MDGPV和MDPV结构蛋白的比较

SDS-PAGE电泳结果显示，MDGPV和MDPV纯化病毒各主要显示3条蛋白条带，根据Quantity One软件推测3条蛋白条带的大小分别为80、65和55 ku(图1).根据Bandscan软件分析80、65和55 ku 3种结构的蛋白含量分别为35%、45%和20%.

表1 番鸭血清的LPAI效价Table 1 LATI of Muscovy duck serum

2.3 免疫印迹结果

2.3.1 MDGPV免疫印迹 从图2可以看出:MDGPV的VP1、VP2和VP3三种结构蛋白能被高免血清G1识别，并以VP3蛋白显色最强(泳道2);同时，高免血清M1也能识别MDGPV的VP3和VP2蛋白，不能识别MDGPV的VP1蛋白(泳道4).

2.3.2 MDPV免疫印迹 从图2可以看出:MDPV的VP1、VP2和VP3三种结构蛋白均能被高免血清M1识别(泳道1);而高免血清G1主要与MDPV的VP3蛋白显色，与VP2蛋白显色较弱，与VP1蛋白不显色(泳道3).2.3.3 MDGPV和MDPV二联疫苗免疫番鸭血清的免疫印迹 从图3可以看出，MDGPV和MDPV二联疫苗免疫的番鸭血清不仅能识别MDGPV的VP1(81 ku)、VP2(65 ku)和VP3(55 ku)3种结构蛋白，也能识别MDPV的3种结构蛋白，进一步证实二联疫苗免疫原性良好，能诱导产生针对MDGPV和MDPV的特异性抗体.

图1 MDGPV和MDPV的SDS-PAGE电泳图谱Fig.1 SDS-PAGE with MDGPV and MDPV structural protein

图2 MDGPV和MDPV纯化病毒与特异性高免血清的免疫印迹结果Fig.2 Immunoblotting results of MDGPV and MDPV in purified virus and specific hyperimmune serum

2.3.4 MDGPV与不同抗体水平番鸭血清的免疫印迹 不同LPAI效价番鸭血清的免疫印迹分析结果(图4、表2)显示:当LPAI效价在24以下时无显色条带或条带很浅;LPAI效价为25-26时，显色率最高的是VP3蛋白，其次为VP1蛋白;效价达29或以上时，3条带均可显色，且以VP3蛋白显色最强.

3 讨论

3.1 结构蛋白分析

关于结构蛋白的大小，不同研究者报道不一，可能与采用的蛋白标准不同有一定关系.本试验采用BioLabs P7708(6-175 ku)预染Marker，应用Quantity One软件推测VP1、VP2和VP3三种结构蛋白的大小分别为80、65和55 ku，蛋白含量经Bandscan软件预测分别为35%、45%和20%.程由铨等[3]采用GIBCO BRL标准蛋白(14-200 ku)，从绘制的标准蛋白曲线查出MDPV的结构蛋白有3条主带，即VP1(89 ku)、VP2(78 ku)和VP3(61 ku)，其中的VP3是主要结构蛋白.1995年匈牙利学者Zádori et al[11]经蛋白凝胶电泳分析表明，MDPV有3条结构蛋白，即3种核衣壳蛋白:VP1(91 ku)、VP2(78 ku)和VP3(58 ku).余兵等[12]经SDS-PAGE分析认为，MDPV和GPV的3种蛋白质分子大小与ORF推测的结果有一定的出入，认为主要原因可能是病毒基因组含有部分重叠基因，而且结构蛋白中可能有1或2个是多聚体，其解聚后大小有一定差异，但具体原因还有待研究.

图3 MDGPV和MDPV纯化病毒与二联疫苗血清的免疫印迹结果Fig.3 Immunoblotting results of MDGPV and MDPV in purified virus and two vaccine immune duck serum

图4 MDGPV与不同LPAI效价番鸭血清的免疫印迹结果Fig.4 Immunoblotting results of MDGPV and different LPAI antibody level in serum of Muscovy duck

表2 MDPV和MDGPV结构蛋白抗原性的免疫印迹结果1)Table 2 Immunoblotting result of MDPV and MDGPV antigenicity of structural protein

3.2 抗原性差异分析

本试验结果表明:MDPV和MDGPV的3种结构蛋白均可被同源抗血清识别，而异源抗血清均不能识别VP1蛋白;同时，对不同效价免疫血清的免疫印迹分析显示，免疫后两周的血清可识别81 ku条带，且LATI效价达24以上时显色更为清晰，提示VP1抗体的产生迟于VP2和VP3抗体.张建珍等[13]在免疫转印试验中发现，抗GPV多克隆血清与GPV的VP1、VP2和VP3蛋白均出现了反应带，而抗GPV的单抗仅能与GPV的VP2和VP3蛋白反应，表明GPV的VP2和VP3蛋白都可能是病毒的保护性抗原.Wang et al[14]通过免疫印迹分析发现，NS蛋白抗体出现最早，接着出现的是 VP3抗体，VP1抗体出现最晚，因此检测GPV结构蛋白和非结构蛋白抗体可揭示GPV感染的不同时期.王劭等[8]对MDGPV VP基因的研究发现:VP2在氨基酸水平上与MDPV的同源性为92%，与GPV的同源性为93%;VP3在氨基酸水平上与MDPV的同源性约为92%，与GPV的同源性大于95%.表明MDGPV在结构蛋白上具有独特的氨基酸序列特征.李俚[15]研究表明:GPV VP1多肽的氨基酸序列与MDPV VP1相比，同源性为87.7%;与腺相关病毒2型相比，同源性为70.2%;腺相关病毒2型与MDPV VP1氨基酸的同源性为70.3%;在GPV VP1多肽第56位氨基酸上有相对保守的酶PGY，GPV与MDPV之间结构蛋白的差异较非结构蛋白大.表明MDGPV与MDPV抗原性的差异主要体现在VP蛋白上.

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