草菇测序菌株杂交子H1521菌丝对非生物胁迫的耐受性

严俊杰，张 云，张 磊，谢 斌，邱庆林，谢宝贵

(福建农林大学菌物研究中心福建福州350002)

草菇(Volvariella volvacea)，又称中国蘑菇，是一种热带和亚热带栽培食用菌，因其味道鲜美、营养丰富，具有降胆固醇、降血压及抗肿瘤等作用，而广受广受消费者喜爱[1].草菇具有生长速度快、耐高温、栽培周期短等特性[2];但是，菌丝容易老化、变异，且子实体产量及性状容易受到环境条件的影响.如:高浓度NaCl中的氯离子对生物酶活性具有很强的抑制作用，从而抑制菌丝生物量的积累[3];而酸、碱以及温度也都会对菌丝体细胞内不同酶的活性产生影响，从而影响其生长速度以及菌丝活力;特别是在4℃低温下，草菇菌丝会发生自溶而死亡，子实体会发软、液化和腐烂，使其栽培、推广、以及采后保藏都受到严重的限制[4，5].因此，对于草菇响应非生物胁迫的机制研究，特别是应答低温胁迫的研究显得格外重要.

本实验室委托深圳华大基因研究院利用高通量测序(Solexa)技术对草菇菌株PYd21、PYd15进行了基因组测序及重测序[6]，这为研究草菇应答非生物胁迫相关基因的筛选提供大量的基础数据.本研究以PYd21及PYd15的杂交子H1521为对象，系统的研究了酸碱度、盐离子浓度、氧化胁迫以及4℃低温胁迫的耐受情况，以期为研究草菇菌丝H1521应答非生物胁迫分子机制的胁迫条件选择提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

H1521为福建主栽品种“屏优一号”分离获得的2个无法正常出菇的单孢菌株PYd15、PYd21通过杂交所获得的可正常出菇异核体菌株，该菌种由福建省食用菌种质资源保藏与管理中心提供，现保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号:ACCC52633.

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化 将供试菌株H1521从PDA斜面中转接到PDA平板上培养2－3代，待菌丝生长速度及形态特征稳定后方可用于后续试验.

1.2.2 pH 梯度试验 参照朱坚等[7]的食用菌生物学特性测定方法，设置 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 十个不同的pH梯度，置于35℃恒温培养箱中避光静置培养，以生长最快的菌落为准，当菌落直径达到1－2 cm时，在所有梯度的菌落边缘画线作为生长起始线;放回35℃培养箱中继续培养，当菌落即将长满培养皿时，再画终止线，并用尺子测量起始线与终止线之间的距离，计算菌丝生长速度并拍照，用DPS软件进行方差分析及差异显著性分析.每个梯度选取3个重复，每个重复测定3个数值.

由于本研究目的在于探究H1521的耐胁迫能力，所设定的pH梯度范围较广，会存在萌发较慢的现象，对于极端pH下培养的菌块如果在拍照时还未萌发，我们会将剩余的平板放回培养箱中继续培养5 d，如还未见其萌发则认为该梯度的pH对菌丝致死.

1.2.3 NaCl浓度梯度试验 将同一批配制好的PDA培养基定量分装于三角瓶中，每瓶200 mL，并向各个三角瓶中分别添加不同量的 NaCl至终浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4 mol·L－1并进行高压灭菌，以未添加NaCl的培养基培养的菌丝为对照标记为CK.接种、培养、菌丝观察及数据统计方法同2.2.

1.2.4 不同H2O2添加浓度的耐受性试验 将同一批配制好的PDA培养基定量分装与三角瓶中，每瓶200 mL进行高压灭菌.待培养基冷却至不烫手但未凝固时，在超净工作台内分别加入不同量的H2O2溶液，使终浓度分别为0.1、1、10和100 mmol·L－1混匀后立即分装到灭菌过的90 mm培养皿中，并做好标记，以未添加H2O2溶液的培养基培养的菌丝为对照标记为CK.接种、培养、菌丝观察及数据统计方法同1.2.2.

1.2.5 不同时间4℃胁迫的耐受性试验 将活化过的平板菌种用8 mm的无菌打孔器取相同大小的菌种块与新的PDA平板中置于35℃培养至菌落直径1－2 cm，取长势较好且长速一致的平板画好初始线后放入4℃冰箱中开始计时，设定冷胁迫时间分别为 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h.取出后立即放回 35 ℃ 培养箱中继续培养24 h，画终止线，测定并计算菌丝的生长速度，用DPS软件进行方差分析及差异显著性分析.每个梯度选取3个重复，每个重复测定3个数值.

2 结果与分析

2.1 H1521菌丝对培养基pH的耐受性分析

由图1及图2可知，草菇H1521的菌丝在pH为4－10的范围内均可生长，不同的pH对菌丝生长影响不同.其中pH为8时，H1521的菌丝浓密，生长速度为2.71 cm·d－1，与其他pH梯度下的生长速度差异极显著.

图1 不同pH梯度条件下草菇H1521的生长情况Fig.1 Growth status of H1521 mycelium under the conditions of different pH

另外，pH为3和12时菌丝均无法萌发，为其致死pH;而pH为11时，培养基中的菌块在拍照4 d后开始萌发，但生长速度缓慢，故认为其生长速度为0.

2.2 H1521菌丝对不同浓度NaCl的耐受性分析

由图3及图4可知，草菇H1521的菌丝在NaCl浓度为0.2 mol·L－1以下时可以较好生长，但菌丝生长速度会随着NaCl浓度的升高逐渐减小;当NaCl浓度达到0.2 mol·L－1以上时菌丝生长速度骤降，与对照有极显著差异.NaCl浓度达到 0.4 mol·L－1时菌丝无法萌发，为菌丝的致死浓度.

图2 pH对菌丝生长速度的影响Fig.2 Effect of pH on mycelial growth rate

图3 不同NaCl浓度梯度下草菇H1521的生长情况Fig.3 Growth status of H1521 mycelium under different concentrations of NaCl

图4 不同浓度NaCl对菌丝生长速度的影响Fig.4 Effect of different concentrations of NaCl on mycelial growth rate

2.3 H1521菌丝对不同浓度H2O2的耐受性分析

由图5及图6可知，草菇H1521的菌丝在H2O2浓度为1 mmol·L－1及以下时可以较好生长，当浓度达到10 mmol·L－1时菌丝生长受到明显抑制但仍可以萌发，此时菌丝的生长速度与CK相比有极显著差异.但当H2O2浓度达到100 mmol·L－1时菌丝没有萌发的迹象，该浓度为菌丝的致死浓度.

图5 不同H2O2浓度梯度下草菇H1521的生长情况Fig.5 Growth status of H1521 mycelium under different concentrations H2O2

2.4 不同时间低温胁迫对菌丝生长的影响

如图7所示，将H1521菌丝置于4℃下孵育0－4 h后菌丝并未自溶，将其放回35℃下继续培养，可恢复正常生长.从图中可以看出，不同时间低温刺激后菌丝恢复的速度不同，0－1 h的生长速度有极显著差异，之后随着冷胁迫的时间增加菌丝恢复所需要的时间逐渐变长，生长速度逐渐变慢，但是总体较为接近.说明第1个小时的低温胁迫对草菇影响较大，但总体来看短时的低温胁迫对菌丝的伤害并不严重.建议4℃胁迫1 h可作为后期低温胁迫机制研究的备选条件.

图6 不同浓度H2O2对菌丝生长速度的影响Fig.6 Effect of different concentrations of H2O2on mycelial growth rate

图7 不同时间4℃胁迫对菌丝生长速度的影响Fig.7 Effect of different durations of low temperature stress on mycelial growth rate

3 小结与讨论

对食用菌的生物学特性的研究，是实现其人工栽培的重要前提.对草菇生物学特性的研究主要集中在温度、pH以及培养基的配比上[1，8－11]，但是对于耐盐性、耐氧化胁迫能力的研究还未见报道.本研究以背景清楚的测序菌株杂交子H1521菌丝为对象，详细探讨了培养基的pH、NaCl浓度、H2O2浓度以及不同时间低温胁迫等因素对其生长的影响，为揭示草菇对各种非生物胁迫的耐受能力提供依据.同时，试验结果将为研究草菇抵抗非生物胁迫机制及其胁迫条件的选择提供参考.

[1]杨维丽，敖莉，李长田，等.草菇菌株的生物学特性比较[J].食用菌学报，2012，18(4):19－21.

[2]蔡爱军，王凤菊，杨文静.草菇高产栽培技术[J].中国食用菌，2005，24(4):50－50.

[3]黄艺，姜学艳，季海波，等.过量钠盐胁迫对种外生菌根真菌生长和钠元素积累的影响[J].微生物学通报，2004，31(3):45－49.

[4]陈明杰，余智晟.草菇组织分离物的遗传变异研究(Ⅱ)[J].食用菌学报，2000，7(2):1－4.

[5]段学斌，庞学群.草菇低温贮藏及有关生理变化研究[J].热带作物学报，2000，21(4):75－79.

[6]MENG L，YAN J，XIE B，et al.Genes encoding FAD-binding proteins in Volvariella volvacea exhibit differential expression in homokaryons and heterokaryons[J].Microbiological Research，2013，168(8):533－546.

[7]朱坚.食用菌品种特性与栽培[M].福州:福建科学技术出版社，2011:14－15.

[8]伍国明，李梅.营养及培养温度对草菇菌丝生长的影响[J].食用菌，2009，3:8－9.

[9]王伟科，周祖法，袁卫东，等.不同营养因子和培养条件对草菇菌株V115菌丝生长的影响[J].北方园艺，2012(21):147－149.

[10]张萍，梁建光，杨立红，等.草菇不同菌株的生物学特性研究[J].中国食用菌，2005，24(2):17－19.

[11]AKINYELE B J，ADETUYI F C.Effect of agrowastes，pH and temperature variation on the growth of Volvariella volvacea[J].African Journal of Biotechnology，2005，4(12):1390－1395.