安石榴甙对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用

李晓娟　贺顺尧(河南省南阳胸科医院检验科，南阳473000)



安石榴甙对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用

李晓娟贺顺尧①(河南省南阳胸科医院检验科，南阳473000)

［摘要］目的:探讨安石榴甙在LPS诱导的急性肺损伤中的保护作用。方法:腹腔注射20 mg/kg体重的LPS(脂多糖)制备ALI(急性肺损伤)小鼠模型，诱导小鼠急性肺损伤。随机将60只小鼠分为6组，每组10只:正常对照组，LPS组，LPS+安石榴甙组(10、20、40 mg/kg体重)，LPS+地塞米松组。安石榴甙和地塞米松均在注射LPS前2 h腹腔注射给药，然后小鼠再腹腔注射致死量的LPS，正常对照组小鼠只给予腹腔注射等体积的PBS。HE染色，观察小鼠肺组织在不同处理条件下的病理变化和肺损伤程度;称量小鼠湿肺、干肺重量，观察小鼠的肺水肿程度;检查肺组织匀浆中的MPO(髓过氧化物酶活性)活性情况，分析中性粒细胞的活化和浸润情况;计数肺泡灌洗液中的细胞总数和炎症细胞的数量，ELISA检测肺泡灌洗液中炎性细胞因子的浓度，分析安石榴甙对炎症反应的影响。结果:小鼠肺组织HE染色结果发现，LPS诱导的肺组织炎性细胞浸润，间质水肿和肺实质的损伤均明显减轻。不同剂量的安石榴甙可以显著减低ALI小鼠中湿肺/干肺重量比(P＜0.05)。说明安石榴甙可以减轻ALI导致的肺组织渗出、水肿。不同剂量的安石榴甙可以显著减少肺泡灌洗液中的炎症细胞总数以及中性粒细胞和巨噬细胞的数量(P＜0.05)。安石榴甙可明显降低肺泡灌洗液中的细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的浓度(P＜0.05)。MPO的活性检测表明，安石榴甙减少了LPS诱导的中性粒细胞在肺组织中的浸润。结论:安石榴甙在LPS诱导的急性肺损伤中具有明显的保护作用。

［关键词］安石榴甙;脂多糖;急性肺损伤

①河南省南阳市南阳胸科医院彩超室，南阳473000。

Protective effects of pomegranate glycosides on LPS-induced acute lung injury to mice

LI Xiao-Juan，HE Shun-Yao.Clinical Laboratory，Nanyang Chest Hospital，Nanyang 473000，China

［Abstract］Objective: To investigate the protective effect of punicalagin in LPS induced ALI.Methods: ALI mice model was induced by intraperitoneal injection of LSP(20 mg/kg bodyweight) to induce acute lung injury in mice.A total of 60 mice were divided into 6 groups，10 rats in each group: normal control group，LPS group，LPS+ punicalagin group (10，20，40 mg/kg bodyweight)，LPS+ dexamethasone group.2 h before LPS injection，punicalagin and dexamethasone were intraperitoneal injection in mice，and then by intraperitoneal injection of a lethal dose of LPS，normal control group mice were given intraperitoneal injection of an equal volume of PBS.HE staining，observed the lung tissue of mice in the different treatment conditions of the pathological changes and the degree of lung injury，weighted the wet lung and dry lung of the mice respectively，observed degree of pulmonary edema in mice，inspect MPO activity of lung homogenate，analyzed the activation and infiltration of polymorphonuclear，counted the total number of cells and the number of inflammatory cells in alveolar lavage fluid，detected the concentration of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid with ELISA，and analyzed the impact of punicalagin on inflammation of lung tissue.Results: HE staining of lung tissue in mice and found that the LPS-induced lung inflammatory cell infiltration，interstitial edema and pulmonary parenchymal damage were significantly reduced.Different dose of punicalagin could significantly reduce the lung wet/dry lung weight ratio of ALI in mice (P＜0.05) .Punicalagin ALI could reduce lung tissue caused exudation，edema.The different doses of punicalagin could significantly reduce the inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid，the sum of the number of neutrophils and macrophages (P＜0.05) .Punicalagin could significantly reduce the concentration in the bronchoalveolar lavage cytokines IL-6，IL-12，TNF-α and IL-1β(P＜0.05) .The MPO activity was detected that punicalagin reduce neutrophil infiltration induced by LPS in the lung tissue.Conclusion: Punicalagin has protective effects on LPS induced acute lung injury.

［Key words］Punicalagin; Lipopolysaccharide; Acute lung injury

急性肺损伤是由于心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性缺氧性呼吸衰竭，临床上是以非心源性肺水肿和顽固性低氧血症为特征的一种综合征［1］。急性肺损伤作为一种严重的疾病仍然具有30%～40%的死亡率，若伴有脓毒症病死率高达90%［2，3］。截至目前报道，急性肺损伤若同时并发4个以上脏器功能障碍，则病死率为100%［4，5］。因此，探索治疗急性肺损伤的有效措施和特效药物是非常必要和迫切的。安石榴甙是从石榴科植物中提取的一种多酚类活性成分。近几年来研究发现，安石榴甙具有很强的抗氧化、抗增殖和抑制肿瘤的作用，以及对抗动脉粥样硬化和抗炎症功能［6-8］。在原代培养的软骨细胞，安石榴甙抑制了LPS诱导的炎症反应［9］。安石榴甙可以抑制LPS诱导的炎症反应，那么是否可以将其用于LPS诱导的急性肺损伤的治疗目前还不清楚。本研究就是通过应用安石榴甙治疗LPS诱导的急性肺损伤，观察安石榴甙在急性肺损伤中的作用。

1　材料与方法

1.1试剂耗材安石榴甙(＞89%)购自北京寰宇科创生物公司，LPS(Escherichia coli O55: B5)购自Sigma公司，细胞因子ELISA检测试剂盒，髓过氧化物酶检测试剂盒购自上海酶联生物公司。

1.1.1实验动物6～8周龄BALB/c小鼠购自河南省实验动物中心

1.2实验方法

1.2.1 ALI小鼠模型的制备随机将60只BALB/ c小鼠分为6组，每组10只:正常对照组，LPS组，LPS+安石榴甙组(10、20、40 mg/kg体重)，LPS+地塞米松组。安石榴甙和地塞米松均在注射LPS前2 h腹腔注射给药，然后小鼠再腹腔注射致死量的LPS(20 mg/kg体重)诱导急性肺损伤。正常对照组小鼠只给予腹腔注射等体积的PBS。LPS注射7 h后，处死小鼠，解剖小鼠取肺脏，收集小鼠支气管肺泡灌洗液。

1.2.2肺组织渗出程度检测(湿肺/干肺重量比)

(1)断颈处死小鼠，解剖小鼠，分离获取小鼠肺脏。(2)称重记录每只小鼠左肺湿肺重量。(3)然后，将左肺置于80℃烤箱内烘烤48 h，直至肺脏完全失去水分，称重获得干肺重量。(4)计算湿肺/干肺的比例评估肺组织水肿的程度。

1.2.3肺脏HE染色(1)将取出的右肺切取一部分放入4%多聚甲醛中固定。(2)将固定过的标本放入脱水机中脱水、透明、浸蜡。(3)经以上处理后将标本进行包埋、切片、染色。(4)用中性树胶封片，显微镜下观察结果。

1.2.4 MPO活性检测(1)取肺组织100 mg加0.5%CTAB溶液1 ml; (2)用玻璃匀浆器制备匀浆，反复冻融(－80℃/37℃)三次; (3) 4℃条件下，3 000 r/min离心15 min; (4)取0.1 ml上清加反应液2.9 ml; (5)保持温度25°C，立即置分光光度计在460 mm波长下进行2 min时间扫描。以第30秒到第90秒的1 min内吸光度的变化代表酶活力的改变。1单位MPO活力以25℃时分解1 mmol过氧化氢来表示。

1.2.5支气管肺泡灌洗液中炎性细胞计数(1)收集支气管肺泡灌洗液，3 000 r/min，4℃离心10 min; (2)弃去上清，50 μl PBS重悬细胞; (3) Giemsa染色，采用血细胞计数器计数支气管肺泡灌洗液中的细胞总数和白细胞分类计数。

1.2.6 ELISA检测细胞因子浓度根据细胞因子ELISA检测试剂盒说明书中的方法，分别检测各组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α 和IL-1β的浓度。

1.3统计学分析所有的数据用x ±s表示，采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2　结果

图1　安石榴甙对LPS诱导的ALT肺脏组织病理变化的影响Fig．1 An punicalagin influence on LPS-induced ALI pathological changes in lung tissue

Note: A.Normal control group; B.LPS group; C.LPS +dexamethasone group; D－F.LPS+punicalagin group(10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg) .

2.1安石榴甙对LPS诱导的ALI肺脏组织病理变化的影响小鼠肺组织HE染色，结果发现，对照组肺脏表现为正常的组织结构和形态特征，LPS组肺脏显示大面积炎性细胞的浸润，肺泡上皮完整性破坏和肺实质的损伤。然而，不同剂量的安石榴甙组LPS诱导的肺组织病理损失均明显减轻，这和地塞米松具有同样的治疗效果(图1)。

2.2安石榴甙抑制LPS诱导的湿肺/干肺重量比

通过称量ALI小鼠经过不同处理后的肺脏重量，计算肺的湿肺/干肺重量比观察肺组织渗出、水肿的情况。结果表明，和正常对照组相比(湿肺的重量是干肺重量的约4倍)，LPS处理后，肺组织的渗出和水肿非常明显，湿肺的重量是干肺重量的约8倍。而不同剂量的安石榴甙或者地塞米松预处理后显著减低ALI小鼠中湿肺/干肺重量比(P＜0.05)。说明安石榴甙可以减轻由于LPS刺激所导致肺组织渗出、水肿。

2.3安石榴甙减少肺组织灌洗液中的炎症细胞注射LPS 7 h后，收集肺组织灌洗液中的细胞，计数灌洗液中的细胞总数和中性粒细胞、巨噬细胞的数量。如图3所示，相对于正常对照组，注射LPS后可以显著提高肺泡灌洗液中的总炎症细胞数量，以及中性粒细胞和巨噬细胞的数量。但是，不同剂量的安石榴甙和地塞米松可以显著减少肺泡灌洗液中的炎症细胞总数以及中性粒细胞和巨噬细胞的数量(图3)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

Note: * .P＜0.05.

图3　安石榴甙减少肺组织灌洗液中的炎症细胞Fig．3 An punicalagin can reduce inflammatory cells in lung tissue lavage fluid

Note: * .P＜0.05.

2.4安石榴甙减少促炎细胞因子的分泌LPS注射后7 h，ELISA检测肺泡灌洗液中细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的浓度。结果表明，LPS处理后，肺泡灌洗液中IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的浓度显著升高。但是，安石榴甙可明显降低肺泡灌洗液中的细胞因子浓度(P＜0.05)，而且这种作用具有剂量依赖性，随着浓度的增加，安石榴甙对炎性细胞因子的抑制作用更加明显(图4)。

2.5安石榴甙抑制LPS导致的MPO活性增加

MPO的活性是中性粒细胞浸润的可信标志。如图5所示，相对于正常对照组，LPS刺激后显著增加了MPO的活性。而安石榴甙组和地塞米松组中LPS引起的MPO的活性增强被明显抑制(P＜0.05)。说明安石榴甙减少了LPS诱导的中性粒细胞在肺组织中的浸润。

Note: * .P＜0.05.

3　讨论

LPS是革兰阴性细菌细胞壁的一种成分，LPS进入肺组织后，可激发机体强烈的炎症反应导致急性肺损伤［10］。炎症反应引起的组织损伤是急性肺损伤的重要病理基础，而局部炎症的特征性标志是细胞的大量聚集，众多细胞因子在中性粒细胞聚集过程中起了重要作用［11］。MPO是中性粒细胞的一种酶，其水平和活性直接反映了中性粒细胞的功能和活化状态［12］。急性肺损伤常伴随有炎症反应及多种炎性细胞因子的释放，引起中性粒细胞的浸润。肺泡灌洗液中白细胞计数和肺组织中MPO可间接

反映肺内中性粒细胞的渗出和积聚量［13，14］。本研究中安石榴甙的使用剂量主要根据Jean-Gilles等人的研究成果［15］。本研究结果表明，安石榴甙可以减轻LPS导致的肺组织的损伤，可以减轻肺组织的渗出和水肿;明显减少了支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数及中性粒细胞和巨噬细胞的数量;可显著减低肺泡灌洗液中细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IL-1β的浓度;减少了中性粒细胞在肺组织中的浸润。综上所述，安石榴甙对LPS诱导的急性肺损伤具有保护作用，但是安石榴甙在急性肺损伤中的治疗剂量和不良反应，有待进一步研究。可望将安石榴甙开发成为一类新的急性肺损伤保护剂而应用于临床疾病的治疗。

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［收稿2015-02-14修回2015-03-18］

(编辑张晓舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．007

作者简介:李晓娟(1974年－)，女，检验科主任，副主任检验师，主要从事临床检验方面的研究。

文章编号1000-484X(2015) 10-1329-04

文献标志码A

中图分类号R392.9