MC4R基因遗传变异与猪生长性状的相关性分析

韩雪蕾，乔瑞敏，李素雅，耿宁权，吕 刚，李改英，李 明，任广志，李新建

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；2.河南省新大牧业有限公司，郑州 45000)

MC4R基因遗传变异与猪生长性状的相关性分析

韩雪蕾1，乔瑞敏1，李素雅2，耿宁权1，吕 刚1，李改英1，李 明1，任广志1，李新建1

(1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；2.河南省新大牧业有限公司，郑州 45000)

为了揭示猪生长性状分子辅助选择标记在不同群体中的遗传效应，本研究采用PCR-RFLP技术，在杜洛克猪、大白猪、长白猪和豫南黑猪群体中对生长性状相关候选基因MC4R的遗传多样性进行检测，并分析其与猪平均日增重、平均日采食量和料重比的相关性。本研究结果显示：MC4R 的D298N 变异位点在4个猪群中均存在多态性，其中G等位基因为优势等位基因；性状关联分析结果显示，在杜洛克猪群体中，GG基因型个体的平均日增重显著高于AA基因型 (P＜0.05)、料重比显著低于AA基因型 (P＜0.05)；在长白猪群体和大白猪群体中GG基因型个体的平均日增重具有高于AA、AG基因型的趋势，料重比有低于AA、AG基因型，但均未达到显著水平(P＞0.05)。

猪；生长性能；料重比；MC4R基因；关联分析

MC4R基因在动物体重、采食量和能量稳态的控制中具有重要作用，在人、猪和马等哺乳动物中研究发现其主要影响机体脂肪、增重、采食等性状[1]。据报道在MC4R基因敲除的小鼠中有大量的脂肪囤积，表现出恶性肥胖，研究表明MC4R基因与肥胖有关。在不同物种中研究发现，MC4R 基因在体重、能量稳态和采食量的调控中发挥重要的作用。Kim等发现在猪MC4R基因中存在一个错义突变D298N，改变了该受体TM7中天冬酰胺的高度保守性，且该多态与采食量、背膘厚、达100 kg体重日龄和生长率存在显著相关性[2-6]。Qiu等研究发现在鸡MC4R基因的5′UTR和CDS中存在4个SNP位点，进一步研究确定4个多态位点与体质量、生长和胴体性状之间存在关联性[7]。

鉴别经济动物重要性状主效基因是极具挑战性的工作，陆续有相关报道， 如IGF2[8]、pRKAG3[9]、RYR1[10]和Pit-1[11]等基因被认为是猪重要经济性状的主效基因，在动物遗传育种工作中具有重大的研究价值。本研究为了进一步揭示MC4R基因在不同种猪群体的遗传变异及其与生长性状间的关系，选取杜洛克猪、长白猪和大白猪和豫南黑猪4个品种，检测MC4R基因的第7跨膜结构功能域的一个高度保守区内的一个G/A突变（D298N）的多态性，并进行了与生长性状之间的关联分析，为分子标记在生长性状选育过程中的应用提供参考和依据。

表1 引物信息

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物包括167头新美系大白猪、71头新美系长白猪、70头新美系杜洛克猪以及375头豫南黑猪。采取试验猪的耳组织样，用耳号钳在猪耳朵下缘的耳缺内，剪下一块猪耳组织，并置于装有75%乙醇的Eppendorf管中，采用酚氯仿法提取DNA，于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 性能测定

所有试验猪在测定过程中，体重30 kg左右开始测定，于120 kg左右结束，体重、日 食量由奥斯本自动饲喂系统进行统计和记录，计算平均日采食量、平均日增重及料重比。

1.3 MC4R基因的PCR-RFLP 检测

1.3.1 引物的设计及PCR扩增

PCR引物合成参考Kim[6]的研究结果，引物序列以及PCR扩增产物的大小见表1，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系如表2所示。PCR反应程序：根据设计的引物对和模板，选用最佳的退火温度，并且根据扩增片段大小的不同，对30个循环中退火及延伸的时间稍做变动，一般在扩增500 bp以下的片段时，时间控制在30～60 s，本试验PCR扩增程序如表3所示。

1.3.2 PCR产物酶切和检测

限制性内切酶混合液体系如表4所示，在37 ℃温度下酶切15 min，配置浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用凝胶成像系统进行拍照。

表2 PCR反应体系

表3 PCR扩增程序

表4 限制性酶切体系

1.4 数据统计分析方法

用EXCEL2007对不同品种猪的平均日采食量、平均日增重和料重比进行统计分析；用Popgene1.32软件计算基因频率、基因型频率，用SPSS20.0进行基因与性状间相关性分析和方差分析，结果以平均数±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 MC4R基因 D298N 主效位点的PCR产物检测及测序

以杜洛克猪、大白猪、长白猪和豫南黑猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到的扩增片段产物，片段清晰，大小一致(226 bp)，回收PCR产物，测序，测得序列与NCBI公布的MC4R基因序列一致，并且含有TaqI内切酶酶切位点；TaqI内切酶能识别TCGA/ AGCT位点，可以进行后续的酶切反应（如图1、图2）。

2.2MC4R基因 D298N 主效位点的酶切检测及结果分析

图1 PCR产物的电泳图

图2 PCR产物测序峰图

图3 酶切产物的电泳图

经TaqI限制性内切酶酶切，酶切后产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳（如图3）。酶切产物为156和70 bp 2条带，298位编码天冬氨酸(GAU)，该基因型定义为AA；酶切产物同时出现226bp、156bp和70 bp 3条带，定义为AG型；当突变G-A发生后，298位编码天冬酰胺(AAU)，TaqI酶切位点消失，酶切产物只有226 bp 1条带，定义为GG型。

2.3MC4R基因D298N 主效位点在不同猪群体中基因型频率和基因频率

利用PCR-RFLP技术对杜洛克猪、大白猪、长白猪和豫南黑猪群体进行MC4R基因型检测，不同群体猪MC4R基因 D298N 主效位点的基因型频率和基因频率见表5。在杜洛克群体中，AG型为优势基因型，基因型频率为0.44，AA型和GG型的基因型频率分别为0.26、0.30，等位基因A基因频率为0.48，等位基因G基因频率为0.52。在大白猪群体中， AA型为优势基因型，基因型频率为0.71，AG型和GG型的基因型频率分别为0.25和0.04；G和A的等位基因频率分别为0.16和0.84。在长白猪群体中，优势基因型为AA型，基因型频率为0.59，AG型和GG型的基因型频率分别是0.34和0.07，G和A的等位基因频率分别为0.24和0.76。在豫南黑猪群体中，优势基因型为AG型，基因型频率为0.49，AA型和GG型的基因型频率分别是0.23和0.28；G和A的等位基因频率分别为0.48和0.52。

2.4MC4R基因D298N主效位点不同基因型与不同品种猪生长性状间的相关性分析

在杜洛克猪、大白猪和长白猪群体中，对MC4R基因不同基因型与平均日采食量、平均日增重、料重比进行关联分析，结果如表6。结果显示：在杜洛克猪群体中，GG型个体的平均日采食量高于其他2种基因型，但差异不显著(P=0.271)；GG型个体的日增重最高，且显著高于AA型个体(P=0.045)，与AG型个体间差异不显著，且AG型与AA型个体间差异不显著；GG型个体的料重比最低，极显著高于AA型个体(P=0.001)，其他基因型间差异不显著（P＞0.05）。在长白猪群体中，3种基因型个体间的平均日采食量、平均日增重和料重比差异均不显著(P＞0.05)；其中GG型个体平均日增重最高，并且料重比最低。在大白猪群体中，3种基因型个体的平均日采食量、平均日增重和料重比差异均不显著(P＞0.05)；其中GG型个体平均日增重最高，并且料重比最低。结果表明，在杜洛克猪群体中，GG型个体的生长速度最快；在长白猪和大白猪群体中，GG型个体比其他2种基因型个体的生长速度快。

表5 MC4R基因在4个中外猪种的基因频率和基因型频率

表6 MC4R不同基因型对不同品种不同生长性状的影响

3 讨论

3.1 猪MC4R基因在不同种群中的多态性分布

国内外有众多的专家学者对MC4R基因进行研究：刘桂兰[12]采用PCRRFLP技术分析了MC4R基因部分片段在猪资源家系群体中的TaqI酶切片段多态性分布，MC4R基因在大白猪群体内存在3种基因型，GG基因型频率最低，优势等位基因为A等位基因；肖石军等人对MC4R基因主效位点在大白猪群体中AA基因型频率最高，A等位基因为优势等位基因；在杜洛克猪群体中，G等位基因为优势等位基因，这些研究结果与本试验的研究结果一致；而在长白猪群体中，GG基因型频率最高，G等位基因为优势等位基因，这与本试验的结果不一致，原因可能是采集的样本品系不同，存在遗传背景差异的结果[13]。本试验通过在豫南黑猪群体中检测MC4R基因的多态性，结果显示：等位基因频率的分布与杜洛克猪相一致，G等位基因为优势等位基因，这与豫南黑猪在育种过程中导入62.5%的杜洛克猪血统有关。

3.2 猪MC4R基因与猪生长性状的关联分析

MC4R在动物体重、采食量和能量稳态的控制中具有重要作用，另外有学者报道MC4R发生突变对动物的生长、脂肪性状产生较大的影响。肖石军等人对MC4R基因与生长肥育性状的关联分析研究发现，相对于AA型个体，GG型个体生长速度更快[9]。本试验结果显示在杜洛克猪群体中，GG型个体的日增重和料重比都是显著高于AA型个体(P＜0.05)，GG型个体的生长速度显著高于另外2种。在长白猪群体和大白猪群体中，3种基因型个体的日采食量、日增重和料重比差异都不显著(P＞0.05)；但是其中GG型个体日增重最高，并且料重比最低，所以，在长白猪和大白猪群体中，GG型个体都是比其他2种基因型个体的生长速度快。

在功能基因的关联性研究中，不同学者经常出现不相同的研究结果，其主要原因是不同试验群体具有不同的遗传背景，使得真正的主效基因与目的标记连锁不平衡程度各不相同，因而，目的标记对所研究性状产生的影响效应也不一样。在许多商业种猪群中，MC4R 基因D298N主效位点并未纯合，这就为种猪的遗传改良提供了可能。由于MC4R基因D298N主效位点GG型个体猪生长更快，而AA型个体生长更慢，可根据其不同的生产和销售目标，选择不同的基因型个体进入核心群，繁育改良核心种猪群的生产性状。

4 小结

猪MC4R基因D298N 主效位点在不同品种群体的基因型频率和基因频率存在差异，本试验进一步验证了MC4R基因多态性对猪生长性状的影响效应，为MC4R基因作为猪分子遗传标记提供一定的依据，同时为利用分子标记选育优良的品种提供一定的参考价值。

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2015-10-13)

河南省生猪产业技术体系创新团队（S2012-06）；国家自然科学基金（U1304325）；郑州科技创新团队（141PCXTD513）。

韩雪蕾（1982-），女，河南周口人，博士，hxl014@126.com

*通讯作者：李新建（1977-），男，河南郸城人，博士，副教授，E-mail:lxjlongfei@163.com