携带抗秆锈病基因Sr25、Sr26小麦新种质的分子标记辅助选育

崔彩红+房伟强+李兴锋+王洪刚+鲍印广

摘 要：源于长穗偃麦草的抗病基因Sr25、Sr26对秆锈病强毒力小种Ug99及其变种具有良好抗性，本实验室前期在长穗偃麦草与普通小麦杂交后代中选育出两个携带Sr25、Sr26基因的八倍体小偃麦。本研究选用济麦22、泰农18、山农637等小麦品种（系）分别与两个八倍体小偃麦杂交、同交，利用与Sr25、Sr26紧密连锁的分子标记进行辅助选择，定向培育出9个含有Sr25或（和）Sr26的小麦新种质。这些新种质综合农艺性状优良，可以作为抗病新种质用于小麦抗病育种，以应对Ug99威胁。

关键词：小麦；秆锈病；Sr25；Sr26；分子标记辅助选择

中图分类号：S512.103.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）04-0013-05

小麦秆锈病是由禾柄锈菌小麦专化型（Puccinia graminis f. sp. tritici）引起的一类真菌性病害，可导致小麦减产75%，甚至绝产。自20世纪70年代开始，各国小麦育种工作者与病理学家共同努力，不断发掘新的抗性基因，特别是源于黑麦1R染色体的Sr31基因的广泛应用，使秆锈病得到了有效控制[2]。然而，1999年乌干达发现了致病力极强的新型秆锈病小种Ug99，它不但克服了Sr31的抗性，而且其变异菌株使得Sr24、Sr28、Sr29、Sr33、Sr36、Sr38等基因也丧失了抗性[3～7]。2006年，在肯尼亚鉴定的我国118份主栽小麦品种中，只有山东省农业科学院育成的济麦20表现高抗，这说明Ug99一旦传入中国，由于现有品种抗性普遍较差，很有可能对我国小麦生产带来灾难性危害[8，9]。

收稿日期：2015-03-10

基金项目：山东省高等学校科技计划项目（J11LC25）；山东省农业良种工程项目“农业生物资源创新利用研究”

研究表明，源于长穗偃麦草（Thinopyrum ponticum）的抗秆锈病基因Sr25、Sr26对Ug99及其变异菌株具有良好抗性[10]。目前，已有学者开发了与Sr25[10，11]、Sr26[10，12]紧密连锁的分子标记，为进行分子标记辅助育种提供了便利。本实验室在普通小麦与长穗偃麦草的杂交后代中，选育出两个八倍体小偃麦SN19和SN20，经分子标记检测，SN19含有Sr26，SN20同时含有Sr25和Sr26。本研究利用不同小麦品种（系）分别与SN19、SN20进行杂交、回交，并利用与Sr25、Sr26紧密连锁的分子标记对其后代进行辅助选择，定向培育携带Sr25、Sr26基因的小麦新种质，为应对Ug99入侵提供种质储备。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用材料包括小麦品种济麦22、泰农18、山农优麦3号、烟农15，本实验室选育的两个八倍体小偃麦SN19、SN20和高代品系山农126、山农637。以上材料均由国家小麦改良中心泰安分中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种质系的创制与选育 分别以八倍体小偃麦SN19、SN20为母本，以普通小麦品种（系）为父本进行杂交、回交，在BC1F1世代利用分子标记辅助选择含有Sr25、Sr26的单株；以普通小麦为轮回亲本与当选单株再进行回交、自交，利用分子标记对每个世代进行辅助选择，结合温室加代，以获得含有Sr25、Sr26且性状基本稳定的种质系。

1.2.2 性状调查 参照李立会和李秀全[3]的方法。

1.2.3 DNA提取 采集新鲜小麦叶片，按CTAB法[4]提取DNA。

1.2.4 引物选择 根据已发表的与抗秆锈病基因Sr25[11]、Sr26[10]紧密连锁的分子标记，由上海生工生物技术公司合成（表1）。

1.2.5 PCR反应体系与程序 引物PSY-E1、Sr26#43+ BE518379的反应体系及扩增程序分别参照Zhang和Dubcovsky[11]、Liu等[10]的方法。

2 结果与分析

2.1 携带Sr25种质的选育

以普通小麦济麦22、山农优麦3号、山农637、山农126为阴性对照，以八倍体小偃麦SN20为阳性对照，利用与Sr25紧密连锁的标记PSY-E1对各世代进行选择，不含Sr25的材料无扩增产物，含有Sr25的材料在191 bp处扩增出一条特异带、如源于SN20/山农637组合的单株204-1、204-3、204-5、204-7、205-1、205-3、205-4、205-5、206-1（图1），源于SN20/济麦22组合的单株180-1、180-2、180-3、180-4、180-10、181-1（图2）均可扩增出大小约191 bp的特异带，说明这些单株含有Sr25，而其余单株则不含Sr25。

2.2 携带Sr26种质的选育

分别以八倍体小偃麦SN19、SN20为阳性对照，以普通小麦亲本为阴性对照，利用引物组合BE518379+Sr26#43对杂种后代进行分子检测。普通小麦只能在303 bp处由引物BE518379扩增出一条源于小麦6A染色体的特异带，阳性对照和含有Sr26基因的后代单株可以在207 bp处扩增出一条由引物Sr26#43产生的Sr26特异带。两个标记结合应用，不但可以检测Sr26基因的有无，还可以检测普通小麦6A染色体是否发生变异。

由图3、图4可以看出，SN20与山农优麦3号杂交后代216-6、217-1、176-8、176-9、176-10单株，SN19与泰农18杂交后代258-2、258-3、258-4、258-6、258-10、259-1、259-3、259-4、259-6、259-7、259-8单株可同时扩增出207 bp和303 bp两条特异带，表明它们含有Sr26基因且6A染色体没有发生变异；单株S258-7仅能扩增出207 bp的特异带，表明其含有Sr26基因，且6A染色体在引物BE518379位点处发生了变异；其余单株仪能扩增出303 bp的特异带，而没有207 bp的特异带，表明它们不含有Sr26，6A染色体也没有发生变异。endprint

2.3 携带Sr25、Sr26种质的性状特点

对部分形态学基本稳定的种质进行性状调查，结果见表2。可以看出，176-8、184-2、193-1、198-10四个种质具有矮秆特点，株高介于64.8～69.2 cm之间；187-4、199-2、259-1、262-2株高中等；而186-2植株则较高，达111.5 cm。穗长方面，只有262-2为8.9 cm，其余皆超过9 cm，199-2和259-1则超过10 cm。就穗粒数而言，9个种质结实性较好，其中184-2、259-1超过50粒。上述种质不但含有Sr25和（或）Sr26基因，而且综合农艺性状较好，可以作为亲本在育种中加以利用。

3 讨论与结论

强毒力小种Ug99及其变异菌株可以侵染全球约90%种植面积的小麦品种，因此引起了世界各国包括诺贝尔奖获得者布劳格博士的高度关注[8]。世界粮农组织为此专门组织成立了“全球小麦锈病协作网”（The Global Rust Initiative），并提出了通过培育多抗性品种持久控制小麦秆锈病的策略[15]，而利用抗病基因创制抗病种质是这一策略得以实施的基础和前提。

Sr25源于长穗偃麦草，位于7E染色体长臂抗叶锈病基因Lr19末端，曾被转移至小麦7D染色体上[16]，被CIMMYT广泛应用于小麦育种中[17]。该基因与高黄色素基因PSY-E1紧密连锁，因此PSy-E1的特异引物可以作为特异标记用于定向检测Sr25。韩建东[18]、吴限鑫[19]等学者曾分别利用特异引物对我国150份小麦材料和云南省119份小麦品种（系）进行检测，均未检测到Sr25，说明该基因在我国较为缺乏。本研究利用特异标记PSY-E1，在八倍体小偃麦与济麦22、山农126、山农637杂交后代中筛选出5个种质，它们不但含有Sr25基因，而且综合农艺性状优良，可以作为亲本用于小麦育种，以改善我国缺乏Sr25基困的境况。

Sr26源于长穗偃麦草，位于6E染色体长臂，曾被转移至小麦6AL上[16]。该基因可以抵抗Ug99及其变异菌株等许多优势小种[10]，自20世纪80年代广泛应用于澳大利亚小麦育种和生产以来，一直保持良好抗性，但在其他国家尚未得到应用[8，9]。在我国，曾有多位学者通过基因推导分析法推测我国部分小麦品种可能含有Sr26[20～23]。2005年，Mago等开发了Sr26的STS显性标记Sr26#43，并用于分子标记辅助选择[12]。之后，经Liu等[10]验证，将小麦6A染色体特异标记BE518379与Sr26#43相结合，可以作为共显性标记用于Sr26的分子诊断，李伟华[24]利用Sr26#43对我国北方448个小麦品种进行检测，结果只有垦九10号和保丰104两个品种含有Sr26本研究结合应用Sr26#43和BE518379两个标记，在八倍体小偃麦与普通小麦品种（系）杂交后代中，选育出5个含有Sr26基因的种质，并且发现其6A染色体均没有发生变异，推测其中的Sr26基因可能转移到了小麦的其它染色体上。

本研究选用农艺性状优良的小麦品种（系）与八倍体小偃麦杂交、回交，在分离后代中利用与抗秆锈病基因Sr25、Sr26紧密连锁的分子标记进行辅助选择，定向培育了4个含有Sr25、4个含有Sr26、1个同时含有Sr25和Sr26的小麦新种质这些新种质结实性好，综合农艺性状优良，可以作为育种亲本用于小麦抗秆锈病育种，以应对Ug99威胁。endprint