‘黄花梨’2个CYP707A基因的克隆和序列分析

黄添毅，李亮，余雪芳，李欣欣，李永裕，吴少华(福建农林大学园艺学院，福建福州35002)

‘黄花梨’是我国南方主栽的一个砂梨品种，属于蔷薇科(Rosaceae)梨属植物(Pyrus L.)，具有良好的风味、丰富的营养，是优良栽培品种之一，栽培范围遍布我国长江流域以南地区，在福建省广受人们的喜爱，福建建宁县更有“黄花梨之乡”的美称。‘黄花梨’具有落叶果树共有的特性，其花芽在冬季会经历休眠，并需要足够的低温积累量才能解除休眠，廖光升［1］认为‘黄花梨’在建宁栽植时花芽休眠期在11月～次年3月份，并需5℃以下低温750 h才能打破自然休眠。如能缩短‘黄花梨’休眠期，将有利于该优良品种的向南推广，但梨休眠生理机制仍很不清楚阻碍了短低温梨育种，不利于扩大梨生长种植南限。因而研究梨花芽休眠的分子机制，阐明梨花芽休眠进程，对于短低温梨育种和早熟梨品种在我国南方推广栽培，促进南方梨产业发展具有重大意义。

脱落酸(Abscisic acid，简称ABA)是植物生长调节剂之一，可以在多种组织中活跃地运转，其作用贯穿于从种子萌发到生殖发育的植物生命周期，介导多种生理过程［2］。研究表明ABA是花芽休眠的促进物和萌发的抑制物，其含量与GA3含量的比例变化对花芽休眠的进程有重要影响［3］。ABA分解途径上关键调控酶ABA 8’－羟化酶的编码基因被证实为 CYP707A，对 ABA 的含量变化有重要作用［4－6］。CYP707A蛋白结构、基本性质等是研究ABA调控梨花芽休眠进程分子机制的重要内容。笔者从‘黄花梨’克隆到2个CYP707A基因，分析CDS序列，探讨生物学信息特征，为进一步分离酶蛋白和研究其功能、活性及阐明CYP707A在‘黄花梨’花芽休眠过程中的调控模式提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 ‘黄花梨’花芽采自福建省建宁县，选取长势健壮梨树作为采样母株。样品取回后，挑取饱满的芽体，去芽鳞片和绒毛，挑取花芽，经液氮速冻于－80℃冰箱贮藏。试验在福建农林大学园艺学院，于2014年1～7月进行。

1.2 主要仪器 冷冻离心机(eppendorf 5810R)、PCR仪(BIO-RAD T100TM Thermal Cycler)、水平电泳槽(DYCP-31DN型)、电泳仪(DYY-10C)、凝胶成像仪(BIO-RAD Universal HoodⅡ)、振荡器(IKA MS 3 B S25)、紫外分光光度计(Quawell q5000，USA)。

1.3 总RNA提取和cDNA合成 液氮研磨花芽后用Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(博日科技有限公司，中国杭州)提纯RNA，并用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。选用TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒(北京全式金有限公司，中国北京)合成‘黄花梨’cDNA，－20℃保存备用。

1.4 基因克隆 以 NCBI数据库下载已登录的蔷薇科CYP707A基因序列作为参考，通过Bioedit软件(版本号:v7.0.9)的blast功能从梨基因组 CDS数据库(Pear Genome Project网站 http://peargenome.njau.edu.cn:8004/)获得同源序列;将同源序列返回到NCBI网站在线blast验证;而后以梨基因组CDS数据库得到的2条序列为参照，设计引物。PCR 反应体系 25 μl(模板 1 μl，10 μmol/μl上游引物 1 μl，10 μmol/μl下游引物 1 μl，10 mmol/L dNTP mixture 1 μl，10× Ex-Taq Buffer 2.5 μl，5 U/μl EX-Taq 0.15 μl，ddH2O 18.35 μl)，目的基因扩增引物见表1。以‘黄花梨’花芽总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增。反应程序:94℃预热5 min;94℃变性45 s，48～55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min;共35个循环，最后72℃延伸10 min;4℃保存。凝胶电泳检测PCR扩增产物(图1)，并切下1 400 bp左右的目的条带，经胶回收(EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金有限公司，中国北京)纯化，连接到PMD18-T(Takara，中国大连)上，后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，在AMP培养基培养大肠杆菌，将菌液PCR鉴定的阳性克隆送至英潍捷基贸易有限公司(中国上海)测序。

表1 目的基因扩增引物

1.5 生物信息学分析 运用blastp在线程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、DNAMAN(6.0.3.99)进行核酸、氨基酸同源性比对及系统发育树分析。运用ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、Npsa － pbil(http://npsa － pbil.ibcp.fr/cgi－ bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)、NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、TMHMM Server V.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM － 2.0/)、TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、Prot(http://psort.hgc.jp/form.html)、SWISS － MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)等在线工具对蛋白质的理化性质、氨基酸磷酸化位点、跨膜螺旋区、信号肽、亚细胞定位及结构等进行分析和预测。

2 结果与分析

2.1 ‘黄花梨’CYP707A基因的克隆 从‘黄花梨’花芽上克隆得到2个CYP707A基因序列，通过DNAMAN比对，发现两者之间的相似性高达94.27%(图2)，氨基酸相似性94.96%。为此，从梨基因组数据库找到2个基因的内含子和外显子基因组序列进行比对，结果显示其相似性为69.95%，说明这2个CYP707A基因为相似性较高的不同基因。将克隆到的‘黄花梨’CYP707A基因分别定名为PpCYP707A4(Genbank登录号:KP279630)、PpCYP707A5(Genbank登录号:KP279631)。

PpCYP707A4的CDS序列全长为1 431 bp，编码476个氨基酸;其氨基酸序列与苹果(Malus domestica XP_008346457.1)相似性 97%，与碧桃(Prunus persica XP_007210577.1)相 似 性 90%，与 梅(Prunus mume XP_008245093.1)相似性87%，与草莓(Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1)相似性83%，与甜橙(Citrus sinensis NP_001275876.1)相似性 84%。

PpCYP707A5的CDS序列全长为1 425 bp，编码474个氨基酸;其氨基酸序列与苹果(Malus domestica XP_008382035.1)相似性 97%，与碧桃(Prunus persica XP_007210577.1)相 似 性 89%，与 梅(Prunus mume XP_008245093.1)相似性86%，与草莓(Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1)相似性84%，与甜橙(Citrus sinensis NP_001275876.1)相似性 85%。

在线blastp分析，2个PpCYP707As基因均具有1个保守结构域，为PLN02196(图3)，属于P450超基因家族。以Pp-CYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作为参考，从NCBI数据库上blast其他物种的CYP707A氨基酸序列，构建系统发育树。仅苹果 blast到2个基因(XP_008346457.1、XP_008382035.1)，其他物种均只blast到1个基因。系统发育树分析显示(图4)，蔷薇科植物的CYP707A基因聚为一大支，PpCYP707A4与苹果 XP_008346457.1基因，PpCYP707A5与苹果XP_008382035.1基因单独聚类。

2.2 蛋白性质预测 采用 ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1预测蛋白性质和Prot预测亚细胞定位，结果显示，PpCYP707A4蛋白的理论分子质量为54.4 kDa，理论等电点为9.01，不稳定系数为48.48，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2493H3901N645O679S20，原子数7 338，带负电荷(Asp+Glu)氨基酸50，带正电荷(Arg+Lys)氨基酸59，脂溶系数为92.39，GRAVY 为 －0.100，是亲水性蛋白;在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～26位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构;不含信号肽，为非分泌蛋白;并定位在内质网，概率为 0.820。

PpCYP707A5蛋白的理论分子质量为54.1 kDa，理论等电点为9.03，不稳定系数为47.78，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2481H3874N640O673S21，原子数7 689，带负电荷(Asp+Glu)氨基酸49，带正电荷(Arg+Lys)氨基酸59，脂溶系数为91.96，GRAVY 为 －0.089，是亲水性蛋白。在6 ～23 位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～27位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构。与PpCYP707A4蛋白相同，也不含信号肽，为非分泌蛋白;定位在内质网，概率为0.820。

2.3 蛋白结构预测 采用Npsa－pbil、NetPhos 2.0 Server在线工具预测蛋白质二级结构、磷酸化位点。PpCYP707A4有243个氨基酸残基形成α－螺旋，32个形成β－螺旋，78个形成延伸链和132个形成无规则卷曲;有12个丝氨酸(serine，S)残基、7 个苏氨酸残基(threonine，T)，2 个酪氨酸(tyrosine，Y)参与磷酸化过程。PpCYP707A5有226个氨基酸残基形成α－螺旋，27个形成β－螺旋，81个形成延伸链和140个形成无规则卷曲;有13个丝氨酸(serine，S)残基、6个苏氨酸残基(threonine，T)，3 个酪氨酸(tyrosine，Y)参与磷酸化过程。Swiss－model预测蛋白三级结构，结果显示 PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的 QMEAN4 值分别为 －5.67、－4.79，三级结构存在较大差异(图5)。

3 讨论

休眠的长短决定落叶果树的地理分布，是落叶果树的重要性状之一［7］。我国梨的种质资源大体分为北方品种群和南方品种群，北方品种群的特点为抗寒力较强、休眠期较长，南方品种群表现出早熟、休眠期短等优势［8］。‘黄花梨’在福建省建宁县能够正常开花结果，产量较大，而在纬度较低的福建省上杭县其萌芽不整齐的现象明显，休眠期的长短对于‘黄花梨’的产量和栽培具有重要的制约作用，休眠影响梨品种的选育和梨产业的发展，研究梨的休眠意义重大。对桃［3］、大樱桃［9－10］、欧洲甜樱桃［11］、葡萄［12］、牡丹［13］等的研究表明ABA的含量变化是影响木本植物芽休眠进程的重要因素。从分子水平探讨ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制，将有利于构建梨休眠的调控网络，从而有助于梨品种的选育。

该研究从‘黄花梨’上分离到ABA分解途径关键酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息学方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，构建相关系统发育树并预测蛋白结构。分析结果显示，PpCYP707A4与PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度较高，为94.27%和94.96%，两者蛋白理化性质相近，符合家族基因的特点。系统进化树显示，‘黄花梨’的PpCYP707A4和PpCYP707A5与苹果的2个基因(XP_008346457.1、XP_008382035.1)分别单独聚类，而非 PpCYP707A4 和 PpCYP707A5 独自聚类。对苹果［14］、大豆［15］、剑兰［16］的研究结果也显示CYP707A家族基因在系统发育树并未单独聚为一类而是分散到几类中。梨基因组数据发表后，Wu等［17］认为蔷薇科的染色体是由祖先7个染色体发展形成的，梨和苹果基因组之间具有高共线性。该研究克隆的2个基因很可能产生于梨和苹果的共同祖先，而后遗传给梨和苹果。CYP707A是一个多基因家族，它们在不同组织中的转录模式不同［2］，以功能交迭的方式参与环境胁迫应答［4，18－19］、休眠解除［20］等不同的生理反应过程，共同调控植物体内源ABA的分解。因而，需进一步研究该基因家族各基因的特性，研究它们的生物学功能，为开展‘黄花梨’花芽休眠的研究提供信息，为短低温梨品种的选育奠定基础。

［1］廖光升.黄花梨低温需冷量研究［J］.落叶果树，2010(1):4.

［2］许智宏，薛红卫.植物激素作用的分子机理［M］.上海:上海科学技术出版社，2012:67－69.

［3］王海波，高东升，王孝娣，等.赤霉素和脱落酸与桃芽自然休眠诱导［J］.果树学报，2006，23(4):599 －601.

［4］SAITO S，HIRAI N，MATSUMOTO C，et al.Arabidopsis CYP707As encode(+)－abscisic acid 8'－hydroxylase，a key enzyme in the oxidative catabolism of abscisic acid［J］.Plant Physiology，2004，134(4):1439 －1449.

［5］NAMBARA E，MARION－POLL A.Abscisic acid biosynthesis and catabolism［J］.Annu Rev Plant Biol，2005，56:165 －185.

［6］KUSHIRO T，OKAMOTO M，NAKABAYASHI K，et al.The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8'‐hydroxylases:key enzymes in ABA catabolism［J］.The EMBO Journal，2004，23(7):1647 －1656.

［7］王海波，高东升，王孝娣，等.落叶果树芽自然休眠诱导的研究进展［J］.果树学报，2006，23(1):91 －95.

［8］柴明良，沈德绪.中国梨育种的回顾和展望［J］.果树学报，2003，20(5):379－383.

［9］段成国，李宪利，高东升，等.剥鳞和激素处理对大樱桃花芽休眠解除及内源激素变化的影响［J］.西北植物学报，2004，24(4):615－620.

［10］段成国，李宪利，刘焕芳，等.摘叶对大樱桃休眠花芽内源激素及活性氧代谢的调控［J］.中国农业科学，2005，38(1):203 －207.

［11］段成国，李宪利，高东升，等.内源ABA和GA3对欧洲甜樱桃花芽自然休眠的调控［J］.园艺学报，2004(2):149－154.

［12］曹慕明，白先进，党剑，等.巨峰葡萄春季催芽过程中芽内内源激素及有机物质变化研究［J］.西北农业学报，2008，17(2):155－160.

［13］郑国生，盖树鹏，盖伟玲.低温解除牡丹芽休眠进程中内源激素的变化［J］.林业科学，2009，45(2):48 －52.

［14］KONDO S，SUGAYA S，SUGAWA S，et al.Dehydration tolerance in apple seedlings is affected by an inhibitor of ABA 8'－hydroxylase CYP707A［J］.Journal of Plant Physiology，2012，169(3):234 －241.

［15］ZHENG Y，HUANG Y，XIAN W，et al.Identification and expression analysis of the Glycine max CYP707A gene family in response to drought and salt stresses［J］.Annals of Botany，2012，110:743 －756.

［16］LUO X，YI J，ZHONG X H，et al.Cloning，characterization and expression analysis of key genes involved in ABA metabolism in Gladiolus cormels during storage［J］.Scientia Horticulturae，2012，143:115 －121.

［17］WU J，WANG Z，SHI Z，et al.The genome of the pear(Pyrus bretschneideri Rehd.)［J］.Genome Research，2013，23(2):396 －408.

［18］YANG S H，ZEEVAART J A.Expression of ABA8'‐hydroxylases in relation to leaf water relations and seed development in bean［J］.The Plant Journal，2006，47(5):675 －686.

［19］YANG S H，CHOI D.Characterization of genes encoding ABA 8'－hydroxylase in ethylene－induced stem growth of deepwater rice(Oryza sativa L.)［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，350(3):685 －690.

［20］OKAMOTO M，KUWAHARA A，SEO M，et al.CYP707A1 and CYP707A2，which encode abscisic acid 8'－ hydroxylases，are indispensable for proper control of seed dormancy and germination in Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2006，141(1):97 －107.