响应面法优化提取益母草多糖工艺

陈庆奇，郑少燕，2，张丹雁

(1.南方医科大学附属佛山市妇幼保健院药剂科，广东佛山528000;2.广州中医药大学中药学院，广东广州510006)

益母草为唇形科植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)的新鲜或干燥地上部分，其味辛、微苦、性微寒，归心、肝、膀胱经，具有活血调经、利水消肿、清热解毒之功效［1］，素有“血家圣药”、“经产良药”之称［2］。益母草中含有生物碱及多糖等多种活性成分［3］，且研究表明益母草多糖(Leonurus japonicus Houtt.polysaccharides，LJP)具有抗氧化［4］、免疫调节活性［5］等活性。因此优化提取LJP条件以便进一步研究LJP活性等具有现实意义。

目前LJP提取工艺虽有报道，但仅见正交设计优化［6］，由于正交设计所得优化参数不能全面考察变量之间的交互作用，LJP提取率仍较低，对其提取方法优化还有待于进一步研究。Box－Behnken设计为响应面法(Response Surface Methodology，RSM)中的一种设计方法，该方法通过多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，能研究几种因素之间的交互作用，可有效解决多变量问题。为此，笔者以多糖提取率为评价指标，选定超声提取温度、提取时间及固液比作为主要考察因素进行单因素试验，再通过3因素3水平Box－Behnken设计试验，建立益母草多糖提取率的二次多项回归方程，计算得到益母草多糖的最佳提取工艺条件，以期为LJP的进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器 UV－2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司);TGL－16B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂);KQ－250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);F1004N万分之一分析天平(上海菁海仪器有限公司);倾斜式粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)。

1.2 材料 益母草(购自广州采芝林药店);无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所，批号110833－200904);苯酚、乙醇、硫酸、丙酮、无水乙醚均为化学纯。

1.3 试验方法

1.3.1 益母草前处理。将益母草粉碎过60目筛，石油醚回流脱脂，95%乙醇回流除去低聚糖及色素，恒温干燥，即得预处理益母草粉末。

1.3.2 多糖含量测定。

1.3.2.1 标准曲线的制作。称取葡萄糖标准品20.1 mg溶解定容至100 ml，摇匀，即得0.201 mg/ml葡萄糖标准溶液。分别吸取葡萄糖标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、8.0 ml，加水定容至10 ml，得标准待测液。再分别吸取2 ml标准待测液，加入2 ml质量分数5%的苯酚，缓慢滴加5 ml浓硫酸，震荡后静置，冷却至室温。另取2 ml蒸馏水以同样的方法配制空白对照组。于490 nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2.2 供试品溶液制备。精密称取益母草粉末5.0 g，加入去离子水，按设定超声提取温度、提取时间及固液比进行提取。将提取液置于离心机中，4 000 r/min离心10 min，回收上清液，下层残渣同法进行二次提取。合并2次离心所得上清液定容至 500 ml，得 LJP 供试品溶液。按“1.3.2.1”项方法进行硫酸苯酚法显色，于紫外分光光度计下200～600 nm扫描。

1.3.2.3 精密度试验。吸取同一已知浓度的LJP供试品6份，按“1.3.2.1”项方法操作，测定 6 份样品吸光度值，计算RSD值，要求该值＜3%。

1.3.2.4 稳定性试验。吸取已知浓度的LJP供试品2 ml，按“1.3.2.1”项方法操作，每隔 1 h 测定 1 次吸光度，连续测定6次，计算RSD值，要求该值＜3%。

1.3.2.5 加样回收率试验。分别吸取已知浓度的LJP溶液6份各1 ml于具塞试管中，分别加入0.21 mg/ml的标准葡萄糖溶液1 ml，按“1.3.2.1”项方法操作，测定吸光度，计算RSD值，要求该值＜3%。

1.3.2.6 多糖的含量测定。吸取不同提取参数下的LJP供试品2 ml于具塞试管中，按“1.3.2.1”项方法操作，测定吸光度，按文献［7］方法计算多糖含量。

1.3.3 单因素对LJP提取率的影响。

1.3.3.1 提取温度对LJP提取率的影响。精密称取5.0 g益母草粉末，加入 15倍量去离子水，分别于 20、25、30、35、40、45℃下超声提取2次，每次20 min，提取功率为320 W，计算LJP提取率，研究提取温度对LJP提取率的影响。

1.3.3.2 提取时间对LJP提取率的影响。精密称取5.0 g益母草粉末，加入15倍量去离子水，35℃下提取2次，每次分别提取 10、15、20、25、30、35 min，超声功率 320 W，计算 LJP提取率，研究提取时间对LJP提取率的影响。

1.3.3.3 固液比对LJP提取率的影响。精密称取5.0 g益母草粉末，35℃下提取20 min，提取2次，超声功率320 W，分别选择固液比为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(m/v，g/ml)，计算LJP提取率，研究固液比对LJP提取率的影响。

1.3.4 响应面试验设计及优化。采用3因素3水平的Box－Behnken设计方法对提取条件进行优化，以单因素最佳条件为Box－Behnken设计的0值(中心值)进行Box－Behnken试验设计。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定的方法学考察

2.1.1 供试品及对照品紫外扫描图。从LJP样品及对照品在200～600 nm波长扫描图(图1)可以看出，LJP样品与葡萄糖对照品在490 nm处均有最大吸收峰。

2.1.2 标准曲线的绘制。通过“1.3.2.1”项检测条件定量测定对照品，绘制标准曲线(图2)，数据经过回归处理，得回归方程 A=0.005 7ρ－0.003 2(R2=0.999 7)，表明葡萄糖标准溶液在20.1 ～160.8 μg/ml线性关系良好。

2.1.3 精密度试验。测定同一已知浓度的LJP供试品6份，得相对标准偏差RSD=0.86%，表明试验精密度良好。

2.1.4 稳定性试验。测定已知浓度的LJP供试品，每隔1 h测定1次吸光度，连续测定6次，得相对标准偏差RSD=1.27%，表明供试品溶液5 h内稳定。

2.1.5 加样回收率试验。按照“1.3.2.5”方法，计算所得加样回收率为98.4%，RSD=1.93%，表明该试验方法加样回收率好，方法可行。

2.2 单因素对LJP提取率的影响

2.2.1 提取温度对LJP提取率的影响。由图3可知，多糖提取率随着提取温度的增加呈先上升再平缓的趋势，这主要因为温度的升高增加了多糖分子的溶出，使得多糖的提取率增加。在35℃之后多糖提取率增加不明显，因此选择35℃为最佳提取温度。

2.2.2 提取时间对LJP提取率的影响。由图4可知，LJP提取率在20 min附近出现最大值，因此，提取时间确定为20 min。

2.2.3 固液比对LJP提取率的影响。从图5可看出，随着固液比的增大，多糖的提取率逐渐上升，当固液比超过1∶20时，多糖提取率增幅不明显，因此固液比选为1∶20。

2.3 响应面试验设计及优化

2.3.1 响应面试验设计。以单因素最佳条件为Box－Behnken设计的中心值(0值)。试验因素及水平如表1所示，Box－Behnken设计的方案及试验结果如表2所示。对表2数据采用Design Expert软件处理、分析，获得LJP提取率(Y)对3个参数的二次多元回归方程:Y=－41.06+1.618X1+1.07X2+0.717X3+0.002X1X2－ 0.01X1X3－ 0.005X2X3－0.021X12－0.025X22－0.0047X32。

表1 响应面分析因素与水平

2.3.2 响应面试验分析及优化。由响应面软件处理所得分析(图6～8)和回归方程ANOVA结果(表3)可见，P模型＜0.01，表明该试验方法可靠;回归系数 R2=0.993 1 ＞0.9，表明回归方程相关度良好;方程“失拟项”不显著，表明回归模型可较好地拟合实际值;回归方程各项参数中X1、X2、X3、X1X3、X2X3、X12、X22、X32均达到显著水平。

Design Expert软件分析所得最优工艺条件为提取温度35.3 ℃、提取时间 20.35 min、固液比 1∶23.66(m/v，g/ml)，LJP提取率可达7.02%。结合实际情况，修正最佳工艺为超声提取温度 35.5 ℃、提取时间 20.5 min、固液比 1∶24(m/v，g/ml)，该条件下，LJP 提取率为(7.10 ±0.13)%(n=3)，与理论值吻合，因此，采用RSM法优化得到的提取条件参数可靠。

表2 LJP超声提取的响应面试验结果

表3 回归系数及显著性检验

3 结论与讨论

该试验使用RSM优化超声提取LJP，得出益母草多糖优化提取条件为提取温度35.5℃、提取时间20.5 min、固液比1∶24(m/v，g/ml)，益母草多糖的提取率为(7.10 ±0.13)%。该研究对提升LJP相关药物的进一步研究开发具有较大的现实意义。通过RSM对超声提取工艺进行优化，相比于正交设计优化超声提取方法［6］，具有提取率高的优势，主要是RSM能同时研究几种因素之间的交互作用，从而计算最佳提取参数。通过单因素分析，当超声提取时间超过20 min左右时，多糖提取率反而会下降，可能因为超声提取时间过长会导致多糖水解或结构遭到破坏，与Ookushi等研究结果［7］相符。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:272.

［2］南京中医药大学.中药大辞典［M］.2版.上海:上海科学技术出版社，2010:2892.

［3］范美华，王健鑫，李鹏，等.益母草的研究进展［J］.中国药物与临床，2006，6(7):528 －530.

［4］梁绍兰，周金花，黄锁义，等.益母草多糖的抗氧化性［J］.光谱实验室，2012，29(6):3666 －3671.

［5］李发胜，赵珏，刘海日，等.益母草多糖对小鼠免疫调节作用的影响［J］.中国中医药科技，2009(4):288 －289.

［6］张金生，杨宏娟，李丽华，等.超声波法提取益母草中多糖方法的研究［J］.食品研究与开发，2013，33(11):103 －106.

［7］OOKUSHI Y，SAKAMOTO M，AZUMA J.Optimization of microwave －assisted extraction of polysaccharides from the fruiting body of mushrooms［J］.Journal of Applied Glycoscience，2006，53(4):267 －272.