巨大芽孢杆菌1259对产蛋鸡不同肠段微生物区系的影响

2015-12-21顾天天朱鹏飞王春园王梦芝张艳云

动物营养学报 2015年9期

顾天天朱鹏飞王春园王梦芝张艳云

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009）

益生菌制剂作为一种高效、安全的饲料添加剂，能明显提高畜禽肠道乳酸杆菌、双歧杆菌等有益微生物的数量，使大肠杆菌和沙门氏菌的数量显著减少。益生菌制剂的作用在家禽生产中尤为显著，主要表现为调节肠道菌群［1］；减少肠道有害菌群的感染［2］；提高蛋品质，改善生产性能［3－4］；此外，部分研究还表明，有些益生菌如巨大芽孢杆菌1259（Bacillus magaterium1259，BM1259）的添加还能减少蛋鸡排泄物中硫化物、氨态氮的浓度，提高氮的利用率从而减少鸡舍内氨气及硫化氢的排放，有效改善鸡舍内的气体环境［5］，而对养殖环境的改善和环境的保护有着重要的意义。芽孢杆菌作为目前研究应用较多的新型益生菌，是一种属于革兰氏阳性菌的好氧菌，易产生具有特殊结构的芽孢，使其在强酸、强碱及高温（100℃）条件下能够生存，同时耐挤压，有利于饲料的加工，在酸性条件下具有较高的稳定性并能分泌活性较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和多种氨基酸［6］。其中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌及东洋芽孢杆菌等被广泛使用［7］。李俊波等［8］报道在蛋鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌可提高蛋鸡的生产性能并提高健康状况。BM1259是正在研究开发的微生物制剂，其一般功效与其他芽孢杆菌相似［9］。本课题组前期的研究已经表明，蛋鸡饲粮添加BM1259的2组产蛋率分别为73.31%、73.61%，均显著高于对照组，且试验组间均无显著差异，添加BM1259有效提高了蛋鸡产蛋率，降低料蛋比，提高蛋白质和能量的消化率［10］，降低氮和硫的排泄［5］。但蛋鸡饲粮中添加BM1259后，其在消化道中对微生物菌群的影响尚不得而知。本试验即以新扬州蛋鸡为研究对象，研究BM1259对产蛋期蛋鸡不同肠段微生物群体的影响，以求初步阐明益生菌BM1259在蛋鸡消化道对微生物群体作用的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验采用的BM1259制剂由“新型生物饲料添加剂——BM1259的研制”课题组提供。试用产品批号20100318，含活孢子数1×1011个／g；Quant SYBR Green PCR试剂盒购于TaKaRa；PCR仪为美国ABI公司的7500；三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris－Cl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、苯酚／氯仿／异戊醇（V／V／V＝25／24／1）、氯仿／异戊醇（V／V＝24／1）、异丙醇和乙醇为国产试剂，蛋白酶K购于上海生工生物股份有限公司，引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.2 试验动物和设计

试验于2013年11月至12月在扬州大学实验农牧场进行，试验选用健康、生长状况相近的45周龄，产蛋率90%的新扬州蛋鸡128只，随机将其分为2个组，每组8个重复，每个重复8只蛋鸡，预试期1周，正试期3周。对照组饲喂基础饲粮；试验组饲粮在基础饲粮中添加2×106CFU／g BM1259制剂。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air－dry basis） %

1.3 饲养管理

扬州大学实验农牧场鸡舍为半开放式鸡舍，阶梯式3层笼养，单笼饲养。采用自动饮水器和食槽饲喂，自然光照。试验期间07：00、16：00各喂料1次，自由采食、饮水，保持鸡舍干净卫生，定期观察鸡群的活动状况，保证鸡群健康。

1.4 样品采集

分别于正试期的第1、2、3周末晨饲前随机从各组抽取8只试验鸡，在宰杀前30min将消毒处理的粪盘放置于各层鸡笼下方用于采集鸡粪样品；而后即可进行宰杀，并迅速在冰盘上无菌分离小肠和盲肠，从各部位挤出内容物采集样品。将样品分别装入离心管并置于－20℃冰箱冷冻保存，用于进行DNA提取。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 细菌 DNA的提取

将收集的样品依照奥斯伯［11］的方法提取DNA。

1.5.2 荧光定量聚合酶链式反应（RT－PCR）法检测

从基因库（GenBank）上获取不同菌株序列，应用Primer 5.0软件分析设计特异性PCR引物（表2）。PT－PCR反应条件为：1）95℃预变性30s；2）95℃变性5s，60℃退火和延伸34s并采集荧光信号，共40个循环；3）熔解曲线分析，以0.1℃／s的速度从60℃升至95℃，60和95℃各保温15s，每升0.1℃采集1次荧光。以细菌U（Bacterial－U）为内参，计算各部位微生物的相对含量。

表2 RT－PCR检测细菌引物列表Table 2 The primers list of detected bacteria in RT－PCR

1.6 数据分析

数据结果以“平均值±标准差”来表示，试验采用Excel 2003建立数据库，采用SPSS 17.0软件中的one－way ANOVA的Duncan氏法进行统计分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

由图1、图2可知，本试验中RT－PCR的标准曲线R2在0.99以上；溶解曲线峰单一，可用于所研究微生物的相对定量。

图1 RT－PCR试验的标准曲线图Fig.1 The standard curve of RT－PCR experiment

图2 RT－PCR试验的溶解曲线图Fig.2 The melt curve of RT－PCR experiment

2.1 巨大芽孢杆菌制剂对产蛋鸡小肠内容物中微生物群体的影响

由表3可知，在正试期第1周，与对照组相比，虽然大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌在小肠内的含量降低，但差异不显著（P＞0.05）；双歧杆菌、拟杆菌在小肠中的含量显著提高（P＜0.05）；巨大芽孢杆菌含量也有提升，但差异不显著（P＞0.05）。在正试期的第2周，与对照组相比，大肠杆菌含量降低，但差异不显著（P＞0.05）；沙门氏菌、肠球菌含量显著降低（P＜0.05）；乳酸菌含量有所提高，但差异不显著（P＞0.05）；双歧杆菌、拟杆菌、巨大芽孢杆菌含量显著升高（P＜0.05）。在正试期的第3周，与对照组相比，大肠杆菌、肠球菌含量降低不显著（P＞0.05）；沙门氏菌含量降低显著（P＜0.05）；乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌含量提高不显著（P＞0.05）；而巨大芽孢杆菌含量则显著升高（P＜0.05）。

由图3可知，在正试期期间，试验组有害菌数量均少于对照组，有益菌数量均多于对照组。

从总体上说，在整个试验期，无论试验组还是对照组，沙门氏菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌在小肠内容物中的含量都表现为降低趋势；大肠杆菌、巨大芽孢杆菌含量则呈现上升趋势；肠球菌含量基本保持不变。

表3 巨大芽孢杆菌1259对产蛋鸡小肠内容物中微生物群体的影响Table 3 Effects of Bacillus magaterium1259on microbial groups in small intestine contents of laying hens

图3 巨大芽孢杆菌1259对产蛋鸡小肠内容物中微生物群体的变化趋势Fig.3 The change trend of Bacillus magaterium1259on microbial groups in small intestine contents

2.2 巨大芽孢杆菌制剂对产蛋鸡盲肠内容物中微生物群体的影响

由表4可知，在正试期第1周，与对照组相比，试验组盲肠内沙门氏菌、双歧杆菌含量显著低于对照组（P＜0.05）；大肠杆菌含量略低于对照组，差异不显著（P＞0.05）；巨大芽孢杆菌含量显著高于对照组（P＜0.05）；乳酸杆菌、肠球菌、拟杆菌含量高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。在正试期第2周，试验组大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌含量显著低于对照组（P＜0.05）；沙门氏菌含量低于对照组，差异不显著（P＞0.05）；拟杆菌含量高于对照组且差异不显著（P＞0.05）；巨大芽孢杆菌含量显著高于对照组（P＜0.05）。在正试期的第3周，大肠杆菌、拟杆菌含量高于对照组且差异不显著（P＞0.05）；沙门氏菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌含量低于对照组，差异不显著（P＞0.05）；巨大芽孢杆菌含量显著高于对照组（P＜0.05）。

由图4可知，在正试期期间，试验组有害菌数量均少于对照组，有益菌数量均多于对照组，且有益菌占主要比例。

在整个试验期，无论试验组还是对照组，大肠杆菌在小肠内容物中的含量都表现为降低趋势；乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、巨大芽孢杆菌含量则呈现上升趋势；沙门氏菌、拟杆菌含量基本保持不变。

表4 巨大芽孢杆菌1259对产蛋鸡盲肠内容物中微生物群体的影响Table 4 Effects of Bacillus magaterium1259on microbial groups in cecum contents of laying hens

图4 巨大芽孢杆菌1259对产蛋鸡盲肠内容物中微生物群体的变化趋势Fig.4 The change trend of Bacillus magaterium1259on microbial groups of cecum

2.3 巨大芽孢杆菌制剂对产蛋鸡粪便微生物群体的影响

由表5可知，在正试期第1周，与对照组相比，试验组粪便中大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌含量显著低于对照组（P＜0.05）；乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌、巨大芽孢杆菌含量高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。在正试期第2周，试验组粪便中大肠杆菌、沙门氏菌含量显著低于对照组（P＜0.05）；乳酸杆菌、肠球菌含量低于试验组且差异不显著（P＞0.05）；双歧杆菌、拟杆菌、巨大芽孢杆菌含量显著高于对照组（P＜0.05）。在正试期第3周，试验组粪便中大肠杆菌、沙门氏菌含量显著低于对照组（P＜0.05）；肠球菌含量低于对照组，但差异不显著（P＞0.05）；乳酸杆菌、巨大芽孢杆菌含量显著高于对照组（P＜0.05）；双歧杆菌、拟杆菌含量高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。

由图5可知，在正试期期间，与对照组相比，试验组有害菌数量呈减少趋势，有益菌数量呈增长趋势，且有益菌占主导地位。

在整个试验期间，对照组和试验组中，大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌含量呈下降趋势；而双歧杆菌、拟杆菌、巨大芽孢杆菌含量呈上升趋势。

表5 巨大芽孢杆菌1259对产蛋鸡粪便微生物群体的影响Table 5 Effects of Bacillus magaterium1259on microbial groups in faeces of laying hens

图5 巨大芽孢杆菌1259对对照组产蛋鸡粪便微生物群体的变化趋势Fig.5 The change trend of Bacillus magaterium1259on microbial groups of faeces

3 讨论

大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌为蛋鸡肠道中的有害菌；而乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌和巨大芽孢杆菌等则是有益菌。本研究发现，与对照组相比，试验组中蛋鸡消化道内容物和粪便的大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌数量减少，双歧杆菌、巨大芽孢杆菌等有益菌数量增加，与景翠等［12］在蛋鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌的试验结果相似。景翠等试验发现添加地衣芽孢杆菌能减少大肠杆菌数量，增加乳酸杆菌、双歧杆菌数量相似。同时本试验结果中肠道各个部位大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌群数量都有所下降，乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌群数量有所提高，以盲肠内容物和粪便中最为明显，这与陈国营等［13］试验证明添加枯草芽孢杆菌能提高盲肠、直肠内容物及粪便乳酸杆菌的数量，降低大肠杆菌数量相似。这可能是由于巨大芽孢杆菌进入畜禽动物肠道后与需氧菌形成竞争关系，夺取氧气，造成低氧环境，抑制了有害菌群的生长，同时改善了肠道中的厌氧环境，为乳酸杆菌等有益菌创造了增殖的条件，有利于有益菌的生长，保持肠道微生物系统的平衡［14－15］。由于乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌在动物肠道内能产生有机酸（如乙酸、丙酸、乳酸、脂肪酸等），使动物肠道保持酸性的条件，而大肠杆菌等有害菌群适宜在中性偏碱的环境中生长繁殖，因此酸性的肠道环境抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，促进乳酸杆菌等有益菌群的繁殖［14－16］。此外，丁轲等［17］报道，乳酸杆菌可通过产生酸性物质、抗菌成分以及各种酶等代谢产物抑制有害菌的活性，从而减少有害菌的数量。同时芽孢杆菌使黏附在肠黏膜上皮细胞上的双歧杆菌、拟杆菌等竞争性抑制病原微生物，同大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌争夺有限的营养物质和生态位点，从而阻碍大肠杆菌与其相应受体结合，继而抑制有害菌群定植，阻碍有害菌的生长繁殖，从而限制有害菌群的生长，提高有益菌群的繁殖［18］。本研究结果表明，与对照组相比，饲粮加入BM1259后，随着时间的增长，试验组有害菌数量明显降低，有益菌数量逐渐增加。这与周小辉等［19］报道动物饲喂芽孢杆菌后能显著降低肠道大肠杆菌的数量，使有益菌数量增加而致使有害菌数量减少，从而增加排泄物中的有益菌数量一致。同样，蜡样芽孢杆菌SA38在体外对鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌进行抑菌试验发现，芽孢杆菌对鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌有明显的抑菌作用，对大肠杆菌也有一定的抑制作用［20］。全艳玲［21］用体外试验也证实，地衣芽孢杆菌对大肠杆菌有抑制作用，对双歧杆菌、乳酸杆菌有共生而无拮抗作用。以上抑菌作用可能是由于芽孢杆菌在代谢过程中产生一些抗生物质（分子质量约1 400u的多肽物质），主要包括伊短菌素（碱性多肽物质，能抑制DNA合成）、杆菌肽（环多肽，能抑制细胞壁合成）和短杆菌素－多黏菌素－短杆菌酪肽类的线多肽抗生素（能改变细胞膜的构造和功能），这3种抗生物质可有效抑制有害菌在肠道的生长，促进有益菌的繁殖［22］。此外还可能是由于芽孢杆菌在厌氧条件下通过糖酵解作用产生一系列有机酸，如挥发性脂肪酸，这些物质可以降低鸡肠道内的pH，有效抑制有害菌的生长，为乳酸菌等耐酸性细菌创造生长的条件所致［23］。

巨大芽孢杆菌的添加除通过维持消化道菌群的平衡、改善消化道酸性环境从而利于机体对营养物质的消化吸收［23］，提高蛋鸡的生产性能外；还可以通过降低氮、硫的排泄，缓解养殖环境的污染状况。李晓刚等［5］前期的试验结果表明，基础饲粮中添加巨大芽孢杆菌后，排泄物中氨态氮及可溶性硫化物的产生量明显减少。这可能是由于大肠杆菌代谢产生氨气［24］，沙门氏菌代谢产生氨和硫化氢［25］，而在饲用巨大芽孢杆菌后大肠杆菌、沙门氏菌数量显著减少，从而降低了氨态氮及可溶性硫化物的释放速度；研究同时还表明，巨大芽孢杆菌还降低了肠道中脲酶、尿酸酶的活性，从而减缓尿酸和尿素的分解，减少硫化氢（H2S）的排出量［8］，而具有缓解排泄物污染的效应。此外，氨、胺和H2S等物质对肠道黏膜细胞有毒害作用，巨大芽孢杆菌的添加缓解这些物质的释放，也对肠黏膜有一定的保护作用而提高动物生产性能。