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红檵木高效再生体系的建立

2015-12-21郑玉娟张党权陈丽莉龚建平周文化何含杰覃杰明

中南林业科技大学学报 2015年4期
关键词:外植体生根分化

陈 容,郑玉娟,张党权,陈丽莉,龚建平,周文化,何含杰,覃杰明

(1.中南林业科技大学 a.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室;b.林业生物技术湖南省重点实验室;c.经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心,湖南 长沙 410004;2 .湖南澧县树大园林有限公司,湖南 澧县 415513)

红檵木高效再生体系的建立

陈 容1a,b,c,郑玉娟1b,张党权1a,b,c,陈丽莉1b,龚建平2,周文化1b,何含杰1b,覃杰明1b

(1.中南林业科技大学 a.经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室;b.林业生物技术湖南省重点实验室;c.经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心,湖南 长沙 410004;2 .湖南澧县树大园林有限公司,湖南 澧县 415513)

红檵木是极具观赏价值的常绿灌木。以红檵木的叶片和茎段为材料,通过优化愈伤组织诱导与增殖,不定芽诱导、增殖与生根的培养基与激素配比,进行红檵木高效再生体系研究。结果表明,红檵木外植体最佳消毒方案为两次升汞消毒法:0.1% HgCl2两次消毒,各3 min;最佳愈伤组织诱导与增殖的培养基配方分别为:MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.7 mg/L、MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.06 mg/L;首次使用AgNO3,获得最佳不定芽诱导培养基配方:MS + 6-BA 1.5 mg/L+ NAA 0.01 mg/L + AgNO31 mg/L;不定芽增殖最佳培养基配方为:MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.05 mg/L + Vc 5.0 mg/L;最佳不定芽生根方案为:选择2.1~3.0 cm的不定芽,保留2~4叶片,接种至1/2 MS + IBA 4.5 mg/L培养基。从而建立了效果稳定的完整红檵木高效再生体系,为红檵木工厂化育苗及转基因体系建立奠定基础。

红檵木;再生体系;不定芽诱导;硝酸银

红檵木又称红花檵木Loropetalum chinensevar.rubrum,金缕梅科檵木属植物,为常绿灌木。红檵木花红叶片红,色彩绚丽,一年3~4次花期,生态适应性强,耐修剪,易造型,广泛用于色篱、模纹花坛、灌木球、彩叶片小乔木、桩景造型、盆景等城市绿化美化。红檵木为白檵木L. chinense的变种,是在特定自然条件下由野生檵木突变而来,其突变途径是个复杂的过程[1],其机理至今仍未探明。自然界中植物的天然突变率极低,红檵木作为世界罕见的植物突变资源,被称为我国特有的“植物中的熊猫”[2]。目前,檵木属中的白檵木、大果檵木、大花檵木3个品种和红花檵木变种产于我国,主要分布于湘赣交界处的罗霄山脉[3-4]。我国红檵木中心产区在湖南,已有70多年栽培历史,面积达3 000 hm2[5]。

目前,红檵木的苗木培育以无性繁殖为主,主要有压条、扦插、嫁接和组织培养等方式,其中扦插方式应用比较广泛。然而,由于扦插存在繁殖系数低、受季节限制等不利因素,研究者开始通过组织培养技术来实现红檵木的工厂化育苗批量生产。1982年宋佩伦等[6]首次进行了红檵木的组织培养,采取茎尖和当年生叶片为外植体,探索通过诱导愈伤组织分化途径形成试管苗;2001年彭海信等[7]以红檵木腋芽为外植体进行了快繁研究;2005年林紫玉等[8]以红檵木茎尖、腋芽等作为外植体进行试管苗诱导研究。

近年来,越来越多的研究开始了对红檵木组织培养体系的更进一步探索,特别是对红檵木不同外植体的消毒方案、不同激素及其浓度对诱导愈伤组织的影响、光照对愈伤组织的增殖影响、不同激素及其配比对愈伤组织分化的影响、以及红檵木丛生芽的诱导等方面都做了一定研究[9-15]。然而,红檵木愈伤组织分化出芽困难等关键问题仍未得到有效的解决,导致目前还没有切实可行的红檵木完整再生体系。基于此,本研究以红檵木的叶片和茎段为材料,通过优化愈伤组织诱导、不定芽诱导与增殖、不定芽生根的最佳培养基与激素配比,建立完整的红檵木高效再生体系,为红檵木工厂化育苗及转基因系统建立提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 外植体采取与表面消毒

(1)外植体采取与预处理

于晴天早晨采取红檵木向阳嫩枝枝顶端含4~6个腋芽的短枝条,长度约10~15 cm。去除该枝条上两年生的老叶片和当年生的幼嫩叶片,保留当年生的成熟叶片,然后将该外植体用洗衣粉水浸泡5 min,并用软绒毛刷去除叶片和茎段表面的脏物,再用流水冲洗1 h左右,最后用去离子水漂洗,备用。

(2)外植体表面消毒

将经预处理的红檵木外植体于超净工作台中进行表面消毒。由于红檵木叶片及木质化程度较低的茎段表面与侧芽有较多绒毛,容易携带大量微生物,不利于表面消毒。因而在表面消毒方案中,关键是优化升汞的浓度与消毒时间。经过前期预试验,设计了两次升汞法表面消毒方案:首先用75%的酒精处理外植体45 s,去离子水清洗两遍(每次4 min);然后分别加入适量的0.1%和0.2%升汞进行两次消毒(表2,共8组处理),每次消毒后都用去离子水充分漂洗两次(每次5 min)。表面消毒后,将外植体用0.1 M氯化钙溶液浸泡一分钟,用去离子水漂洗一遍,备用。

1.2 愈伤组织的诱导培养

以MS为基本培养基,将植物激素6-BA和NAA设计6个组合(表3),对红檵木外植体进行愈伤组织诱导培养。将经过表面消毒的红檵木叶片和茎段取出,于含滤纸的培养皿中吸干表面水分,用解剖刀在叶片表面横切一次,然后将叶片正面朝下平铺于培养基表面;同时,将枝条斜切成1.5~2 cm的茎段(含一个腋芽),斜插入培养基中,最后将接种有外植体的组培瓶于光照培养室中培养,培养温度为(25± 1)℃,光照强度为2 000 lx,光照时间为12 h/d,并定期观察生长情况。

1.3 愈伤组织的增殖培养

本研究以MS为基本培养基,设计了6个植物激素6-BA和IBA的组合处理(表1),对红檵木愈伤组织进行增殖培养。待新愈伤组织生长至一定程度后,切下生长状况良好的部位继续转至新的增殖培养基中,每3周继代转瓶一次,每次转瓶时需将褐化部位切掉。愈伤组织在继代培养3~4次后,可用于后续的不定芽分化诱导培养。

表1 红檵木愈伤组织增殖培养的激素组合Table 1 Hormone combination for callus multiplication of L. chinense var. rubrum

1.4 不定芽诱导培养

以MS为基本培养基,对6-BA、NAA和AgNO3设计30个组合处理(表4),对红檵木愈伤组织进行不定芽诱导培养。从增殖培养瓶中选取暗红色或略带绿色的致密度适宜的红檵木愈伤组织,切成0.5 mm左右的小块,放入不定芽诱导培养基中进行分化培养。不定芽诱导的培养条件为:温度(25±1)℃,光照强度2 000 lx,光照时间12 h/d。

1.5 不定芽增殖培养

将分化的红檵木不定芽从愈伤组织上切下,转至MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.05 mg/L + Vc 5.0 mg/L的增殖培养基中,进行不定芽的增殖和壮苗培养。培养条件为:温度(25± 1) ℃,光照度2 000 lx,光照时间12 h/d。

1.6 不定芽生根诱导培养

分别以1/2MS和3/4MS为基本培养基,设置3个IBA浓度,共6个组合处理(表5),对红檵木不定芽进行生根诱导培养。将壮苗培养后的红檵木不定芽转至生根诱导培养基中,并记录各组植株的株高和叶片数,暗培养3 d,然后转入光照培养室,培养条件为:温度(25±1)℃,光照度2 000 lx,光照时间12 h/d。接种一个月后统计各组处理的生根情况。

2 结果与分析

2.1 红檵木外植体的高效表面消毒

外植体在接种培养了15 d后,分别对不同消毒实验处理的叶片与茎段进行观察,并统计不同处理的微生物污染率、褐化率及存活率(表2)。结果表明,在两次升汞法表面消毒方案中,以两次0.1% HgCl2、消毒时间均为3 min的效果最佳,外植体的微生物污染率和褐化率都为最低,过长或过短的消毒时间都难以实现同时对微生物污染率和褐化率的有效控制。因此,红檵木外植体的高效表面消毒方案为:采用当年生的幼嫩茎段或成熟叶片,75%的酒精漂洗外植体45 s,二次0.1% HgCl2消毒 3 min。

声纳图像在映射过程中损失了高度信息,光学图像中采用多视图几何原理,利用不同映射角度的图像视差关系计算目标的深度信息以恢复三维特征。但由于光学摄像机与声纳设备映射原理的差异,所以一般的基于光学的三维重建方法不能直接运用到声纳图像的三维重建过程中。根据多视角声纳图像的映射特点,本节提出一种对高度弧分段、逐级搜寻目标的空间位置的多视角声纳图像三维特征重建方法,用于恢复图像的高度特征。

2.2 红檵木愈伤组织的高效诱导与增殖培养

将红檵木外植体接种至愈伤组织诱导培养基(图1-A),5 d后就开始长出愈伤组织,30 d后生长明显(图1-B)。对生长30 d的茎段和叶片愈伤组织诱导情况进行统计(表3)。分析结果表明,NAA对红檵木愈伤组织的诱导有显著的作用,而6-BA的作用效果相对较弱。因此,红檵木愈伤组织诱导的最佳激素组合为A5,培养基配方为:MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 1.7 mg/L。

获得质量较好的红檵木愈伤组织后,使用不同浓度配比的6-BA、IBA进行增殖培养(图1-C)。分析结果表明,当IBA浓度达到1 mg/L以上时,会使愈伤组织快速增殖结构松散;当IBA浓度低于0.04 mg/L时,增殖速度较慢;当IBA浓度为0.06 mg/L时可以得到质量最佳的愈伤组织,颜色表现为暗红色。因此,红檵木愈伤组织增殖的最佳激素组合为B4,培养基配方为:MS +6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.06 mg/L。

表2 红檵木外植体表面消毒结果统计情况Table 2 Statistics of explant surface disinfection of L. chinense var. rubrum

表3 红檵木愈伤组织诱导培养的激素组合及相应的诱导率Table 3 Hormone combination for callus induction and induction rate of L. chinense var. rubrum

2.3 红檵木不定芽的高效诱导与增殖培养

在接种至不定芽诱导培养基一周后,红檵木愈伤组织开始分化,生长至4周后已有较多叶片(图1-D、E)。统计不同激素配比下愈伤组织的分化情况(表4)。为解决红檵木愈伤组织不定芽诱导的难题,首次尝试在诱导培养基中添加AgNO3,结果表明,加入AgNO3能显著刺激愈伤组织分化出不定芽,不同AgNO3浓度与不同的激素组合表现出差异性的分化效率。整体而言,1 mg/L的AgNO3在不同激素浓度组合中均能取得较好的不定芽诱导效果;C12处理组虽然是不定芽诱导率最高的组合,但是AgNO3浓度过高(3 mg/L),对愈伤组织与不定芽本身也会产生一定的毒害作用,长期培养不利于生长。因此,红檵木愈伤组织的不定芽诱导最佳培养基配方为:MS + 6-BA 1.5 mg/L + NAA 0.01 mg/L+ AgNO31 mg/L。

参考李琦[16]在丛生芽诱导中的配方,设计了红檵木不定芽增殖方案,获得了最佳培养基配方:MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.05 mg/L + Vc 5.0 mg/L,结果表明,该配方对红檵木不定芽的增殖有很好的效果,接种一个月后不定芽得到稳定增殖(图1-F),其生长情况也很适合下一步的生根诱导。

2.4 红檵木不定芽的高效生根诱导培养

红檵木不定芽在接种培养第7 d后开始逐渐生根,同时培养基底部还会长出枚红色的愈伤组织,并且伴有植株长高及少量侧枝生长的现象(图1-G、H、I、J)。培养30 d后统计不定芽的生根情况(表5),并得到叶片数和株高对不定芽生根的作用关系(表6、表7)。

表4 红檵木愈伤组织不定芽诱导培养的激素组合及分化情况Table 4 Hormone combination on adventitious bud induction and differentiation of L. chinense var. rubrum

图1 红檵木高效再生体系建立Fig. 1 Establishment of high-eff i cient regeneration system of L. chinense var. rubrum

表5 红檵木不定芽生根诱导的培养基与激素及相应的生根率Table 5 Medium and hormone for adventitious bud rooting induction and corresponding rooting rate of L.chinense var. rubrum

由表5可知,MS培养基中添加3.5 mg/L~4.5 mg/L IBA的情况下,红檵木不定芽都能有效生根,但生根率相差不大,其中1/2 MS的生根率略高于3/4 MS的生根率。

表6 红檵木不定芽株高对生根的影响Table 6 Influences of plant height on adventitious bud rooting of L. chinense var. rubrum

由表6可知,高浓度的IBA更容易促进相对株高较长的红檵木不定芽生根,其中IBA为4 mg/L时,2.1~3.0 cm的植株高度占到46.84%;另外,当红檵木不定芽高度低于1 cm或者高于4 cm时,都不容易生根。

综合不定芽生根率与植株高度以及植株保留叶片对生根的影响3个因素,得到红檵木不定芽诱导生根的最佳方案:选择2.1~3.0 cm高度的植株,保留2~4片叶,接种至1/2 MS + IBA 4.5 mg/L的培养基。

3 结论与讨论

(1)影响愈伤组织不定芽诱导的因素。

表7 红檵木生根不定芽中叶片数与植株高度的关系Table 7 Relationship of leaf number and plant height in rooted adventitious buds of L. chinense var.rubrum

在红檵木再生体系建立过程当中,愈伤组织的高效与稳定分化一直是关键难题。本研究从内在因素和外在因素两个方面出发,探讨影响红檵木愈伤组织不定芽分化的因素。内在因素主要包括外植体的来源、生长环境、发育状态等,外在因素主要包括激素的选择与配比、培养基的选择、胚性愈伤组织的挑选。

在生长调节剂的选取过程中,本研究选择的是最常见的生长素NAA和细胞分裂素6-BA。NAA有促进细胞分裂与扩大的作用,高浓度NAA可促进愈伤组织形成不定根,而低浓度NAA能促进愈伤组织形成不定芽。因此,本研究选取的NAA浓度严格控制在0.01 mg/L~0.09 mg/L之间。6-BA有促进细胞分裂以及非分化组织分化的作用,与其他激素的组合能促进粗皮柠檬、匐枝栓果菊、越南槐[17-19]等植物的愈伤组织大量分化出芽,特别是与NAA组合在提高胚性愈伤组织和促进离体组织的再生能力方面有着重要作用[20]。AgNO3在促进器官发生、体细胞胚胎发生、以及抑制乙烯活性方面有显著的特殊功效[21-23],有实验研究表明,高浓度AgNO3抑制小麦花药愈伤组织分化,而低浓度则促进分化[24-25]。为解决红檵木愈伤组织分化难与分化不稳定的问题,本论文首次尝试在不定芽诱导培养基中加入适量的硝酸银,显著提高了红檵木愈伤组织的不定芽分化率,分化效果也非常稳定。

(2)影响不定芽增殖的因素。

愈伤组织分化的不定芽是长时间在各种内源激素和外源激素共同作用下的结果。6-BA能有效促进不定芽的增殖,但还能促进酚类化合物的合成与刺激多酚氧化酶的活性,从而导致愈伤组织易发生褐变死亡。因此,在培养基中加入适量Vc类抗氧化剂[26],能有效解决在红檵木不定芽增殖过程中引起的愈伤组织褐变问题。另外,红檵木愈伤组织在含AgNO3的不定芽诱导培养基中培养时间越长,积累的AgNO3就越多,不利于后期的不定芽增殖培养。因而,当红檵木愈伤组织分化出的不定芽生长至一定高度后,需及时转瓶至增殖培养基中。

(3)影响不定芽生根的因素。

除外源激素配比、培养基类型外,本研究还探索了不定芽株高、不定芽叶片数对红檵木不定芽生根的影响。由本研究的研究结果可知,不定芽植株太矮时,一般都难以生根,外源激素对其作用不大。但是接种的不定芽高度超过4 cm时,植株木质化程度较高,也较难生根。因此,选择适宜高度的红檵木不定芽能有效提高生根率。另外,在接种时,选择适宜数量叶片的不定芽,也能起到促进不定芽生根的效果。就外源激素而言,IBA对不定芽的生根有重要的影响[27-30]。本研究显示,在红檵木不定芽的生根培养中,高浓度IBA(3.5 mg/L)的生根效果较为理想。

(4)红檵木高效再生体系与转基因研究。

红檵木为极其珍贵的天然植物突变体,但其突变机理仍未探明。目前,课题组通过转录组研究获得一些红檵木中特异表达新基因,对其进行功能研究时,需通过转基因技术实现这些基因在红檵木体内的过量表达与下调表达。然而,高效再生体系的缺失导致红檵木转基因系统难以建立,制约了红檵木特异新基因的功能研究。因此,本研究建立了效果稳定的红檵木高效再生体系,为后续的转基因研究奠定了基础。

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Establishment of high-eff i cient regeneration system ofLoropetalum chinensevar.rubrum

CHEN Rong1a,b,c, ZHENG Yu-juan1b, ZHANG Dang-quan1a,b,c, CHEN Li-li1b, GONG Jian-ping2,ZHOU Wen-hua1b, HE Han-jie1b, QIN Jie-ming1b
(1. Central South University of Forestry and Technology;1a) Key Lab. of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees,Ministry of Education; 1b) Hunan Provincial Key Lab. of Forestry Biotechnology; 1c) Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province, Changsha 410004, Hunan, China; 2, Hunan Lixian Shuda Garden Co. Ltd.,Lixian 415513, Hunan, China)

Loropetalum chinensevar.rubrumis a kind of evergreen shrub which has great ornamental value. Using stems and leaves as explant, the high-efficient regeneration system ofL. chinensevar.rubrumwas researched by optimizing the medium type and hormone combination in induction and multiplication of callus, induction and rooting of adventitious buds. The results show that the optimal sterilizing conditions was: disinfected twice with 0.1% HgCl2sterilization each lasted 3 minutes; the optimal mediums for callus induction and multiplication were: MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA1.7 mg/L and MS + 6-BA 1.0 mg/L+ IBA 0.06~0.08 mg/L,respectively; By introducing AgNO3fi rstly, the optimal medium for adventitious bud induction was conf i rmed as: MS + 6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L + AgNO31 mg/L; the optimal medium of adventitious bud multiplication was: MS + 6-BA 1.0 mg/L + IBA 0.05 mg/L+ Vc 5.0 mg/L. The optimal program for rooting of adventitious bud is as follows steps: choosing 2.1~3.0 cm tall buds with 2~4 leaves and inoculating to the medium 1/2 MS + IBA 4.5 mg/L. Thereby, the high-eff i cient regeneration system ofL. chinensevar.rubrumwas established, and this system provide a basis for establishing the transgenic system and implementing industrialized breeding and seedling.

Loropetalum chinensevar.rubrum; regenetation system; adventitious bud induction; silver nitrate

S722.3+7

A

1673-923X(2015)04-0040-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.04.007

2014-08-06

国家林业公益性行业科研专项(201204610);湖南省科技计划重点项目(2014FJ2004)

陈 容,硕士研究生 通讯作者:张党权,教授,博导;E-mail:zhangdangquan@163.com

陈 容, 郑玉娟, 张党权,等. 红檵木高效再生体系的建立[J].中南林业科技大学学报,2015,35(4):40-45.

[本文编校:文凤鸣]

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