近红外和中红外光谱技术在快速鉴别豆粕中掺入尿素聚合物的研究

孙丹丹 李军国 秦玉昌 董颖超*

(1.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081;2.农业部食物与营养发展研究所，北京 100081)

豆粕作为主要的植物性蛋白质饲料原料，在畜禽、水产及特种动物养殖中应用广泛。但是，由于利益的驱动，一些商家在豆粕中掺入一些含氮量高的化合物来提高粗蛋白质含量，尤其在食品和饲料中检出三聚氰胺后，虚增蛋白质类物质引起了广泛关注。经调查发现，尿素聚合物是所添加的虚增蛋白质类物质之一，即以尿素为原料经热加工制得。使用尿素的原因是尿素廉价且含氮量高(46.7%)，常规的检测方法“凯氏定氮法”不能区别蛋白氮和非蛋白氮，但尿素吸湿性强，直接添加容易被发现，而将尿素热加工后，可形成白色固体，其主要成分是缩二脲、缩三脲、三聚氰酸等缩合物［1］，凯氏定氮法测得其含氮量约为40%。缩二脲的检测方法有分光光度法和高效液相色谱－串联质谱法［2－3］，三聚氰酸的检测方法为色谱法［4－5］，但这些检测方法需要化学试剂，对操作人员的要求高，耗时长。

红外光谱技术是一种快速有效的检测技术，在食品掺假中应用广泛［6－7］。在饲料掺假方面，Haughey等［8］利用近红外(near infrared，NIR)光谱技术检测豆粕中的三聚氰胺，最低测定质量浓度达到0.1%;杨增玲等［9］应用可见 －NIR光谱技术结合偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对掺有肉骨粉的鱼粉进行快速鉴别，掺入量≥5%时正确率为100%;刘星［10］采用主成分分析结合支持向量机(SVM)化学计量学算法，分别对掺入5% ～15%的三聚氰胺甲醛树脂和脲醛树脂的奶牛精补料正确识别率为100%;石光涛等［11］应用可见 －NIR光谱技术结合PLS-DA对掺有豆粕的鱼粉进行判别，掺入豆粕浓度为2%～50%时，检验集的正确判断率为96.12%。应用NIR光谱技术测定饲料中肉骨粉含量也有很多文献报道［12－16］。中红外(mid infrared，MIR)光谱技术在食品掺假如蜂蜜、果汁、巧克力、油脂等方面应用较多［17］，对于粉状样品的研究较少。Liu等［17］应用MIR光谱技术结合PLSDA预测藕粉中掺假物质的含量，外部验证决定系数为 0.98，标准偏差为 5.47;刘嘉等［19］对葛粉中分别掺入红薯粉和马铃薯粉的MIR光谱进行Fisher判别，交互验证准确率分别为86.7%和92.0%。因此，红外光谱法可作为一种快速高效可靠的方法用于检测食品和饲料掺假。本研究目的是评价近红外和中红外光谱分析技术结合模式识别法对鉴别掺有尿素聚合物的豆粕的准确性，探讨其作为高效可靠分析技术的可行性和实用性。

1 材料与方法

1.1 样品制备

豆粕采自中粮东海粮油工业有限公司，共30批次145个样品，样品于高速旋风粉碎机粉碎30 s。尿素聚合物是由尿素(西陇化工股份有限公司)加热成固态并粉碎成粉末状。根据尿素聚合物对不同谱区吸收值的不同，NIR和MIR的样品分别制备不同的质量浓度(表1)。

表1 校正集和验证集豆粕样品中尿素聚合物含量Table 1 Urea polymer concentration of calibration set and validation set in soybean meal samples

1.2 试验仪器及软件

MATRIXTM-Ⅰ型傅立叶变换近红外光谱仪(BRUKER，Germany)，带漫反射积分球附件、三维立体角镜 RockSolidTM干涉仪，Pbs检测器。OPUS 光谱采集软件(version 7.0;Bruker，Germany)。TENSOR 37型傅立叶红外光谱仪(BRUKER，Germany)。 Matlab(v2013b，MathWorks，USA)和 Unscrambler(version 9.8;CAMO，Norway)化学计量学分析软件。

1.3 光谱采集

NIR光谱采集:扫描范围为12 500～3 598 cm－1，分辨率为 8 cm－1，扫描次数 64 次;开启旋转样品台，试验环境温度为(25±2)℃;每次扫描样品前，仪器预热30 min以上;每个样品重复装样扫描3次。为了减少随机误差，随机抽取样品进行光谱数据采集。

MIR光谱采集:称取溴化钾(KBr)200 mg，KBr与样品的比例为50∶1，将试验样品与KBr研磨混匀，在压力13 MPa下压片1 min;光谱范围4 000 ～400 cm－1，分辨率为 4 cm－1，扫描次数 64次;每次扫描样品前，仪器预热30 min以上;试验环境温度为(25±2)℃;每个样品重复扫描2次。

1.4 数据分析

样品光谱常因受到高频随机噪声、光散射、样品不均匀等因素的影响，而产生干扰信号。常用的预处理方法有多元散射校正(MSC)、变量标准化(SNV)、一阶导数(1Der)、二阶导数(2Der)等，这些数据处理方法可以提高分析信号的信噪比，校正样品因散射而引起的光谱的误差，消除基线漂移和背景。使用一种或多种组合处理方法能提高定性分析中样品分类准确率及定量分析中预测精度［19］。

本试验采用PLS-DA和SVM分类方法，识别率和检测限为评价模型优劣的指标。在PLS-DA方法中，令纯豆粕样品值为0，掺假豆粕为1，阈值设置为0.5，即当样品预测值小于0.5时判为豆粕，否则判为掺假豆粕。

2 结果与分析

2.1 NIR光谱分析

2.1.1 样品NIR光谱分析

尿素聚合物的主要成分是缩二脲、缩三脲和三聚氰酸，其化学结构如图1所示。纯豆粕和掺入5%尿素聚合物豆粕的NIR原始光谱，如图2所示，在7 567～3 695 cm－1区间的差异，主要是由于聚合物中氨基(－NH2)和羟基(－OH)引起的。伯酰胺和仲酰胺的一级倍频吸收带在6 666 cm－1附近，合频在5 000 cm－1附近，－OH的一级倍频约在6 993 cm－1附近，合频约在5 000 cm－1附近［20］。

图1 缩二脲(a)、缩三脲(b)和三聚氰酸(c)的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of biuret(a)，triuret(b)and cyanuric(c)acid

图2 纯豆粕与掺假豆粕NIR光谱特征Fig.2 Near infrared reflectance spectroscopic characteristics of pure soybean meal and adulterated soybean meal

2.1.2 PLS-DA 模型的建立与验证

利用偏最小二乘回归方法对校正集样品的NIR光谱和样品的分类变量进行回归分析，建立NIR光谱与分类变量间的分类模型。对光谱进行无处理、平滑、变量标准化、求导等预处理后建立PLS-DA判别模型，其判别结果基本一致。图3为原光谱经变量标准化后，得到的校正集和验证集的结果，图3(a)为校正集样品交叉验证结果，尿素聚合物的含量为1%时，预测值小于0.5，被误判为纯豆粕;图3(b)为验证集样品判别结果，当尿素聚合物的含量为1%时，预测值小于0.5，被误判为纯豆粕。因此，采用PLS-DA判别方法结合NIR光谱技术识别掺入尿素聚合物的豆粕的检测 限大于1.0%。

图3 校正集(a)和验证集(b)样品PLS-DA模型的判别结果Fig.3 Discriminant results for samples in calibration set(a)and validation set(b)by PLS-DA models

2.1.3 SVM 模型的建立与验证

原始光谱经变量标准化后，选择6 688.3～3 606.4 cm－1之间的光谱数据，输入到SVM 分类器中，选择径向基作为核函数，得到SVM分类结果，迭代次数673次，支持向量的个数208，边界支持向量的个数16。图4为训练集和测试集样品判别结果，判断准确率分别99.80%和99.21%，即2个样品集中各出现1个误判样品，其尿素聚合物的含量为1%，被误判为纯豆粕样品。因此，采用SVM分类方法结合NIR光谱技术识别掺入尿素聚合物的豆粕的检测限大于1.0%。

图4 训练集和测试集样品SVM模型的判别结果Fig.4 Discriminant results for samples in training set and testing set by SVM models

2.2 MIR光谱分析

2.2.1 样品 MIR光谱

尿素聚合物是缩二脲(图1a)、缩三脲(图1b)、三聚氰酸(图1c)等的混合物。其中，缩二脲的酰亚胺中的羰基偶合裂分为双峰在1 745～1 680 cm－1区域，伯胺N－H的伸缩振动在3 500～3 300 cm－1之间有2个峰，剪式振动在1 650～1 580 cm－1，仲胺N－H的伸缩振动有1个峰，剪式振动在1 650～1 515 cm－1附近，C－N的伸缩振动在1 350～1 000 cm－1之间;三聚氰酸中的－OH形成氢键，吸收峰在3 500～3 200 cm－1处，内酰胺因环的张力增加，羰基峰频率升高，C=N的伸缩振动在1 690～1 550 cm－1附近。在537 cm－1处有一个尖的强吸收峰无法辨认，可能是尿素中的杂质在加热过程中发生聚合反应，在掺假豆粕中此峰随着尿素聚合物含量的增加而增强，如图5所示。

图5 尿素聚合物(a)和掺假豆粕(b)的MIR光谱特征Fig.5 The mid infrared spectrum of urea polymer(a)and adulterated soybean meal(b)

2.2.2 PLS-DA 模型的建立与验证

除去水峰和二氧化碳峰后，对光谱进行无处理、平滑、变量标准化、求导等预处理后建立PLS-DA判别模型，预处理方法对模型的影响较大，最终选择最佳预处理方法为变量标准化和一阶导数7点平滑的组合，图6为原始光谱经变量标准化和一阶导数7点平滑组合处理后，得到的校正集和验证集样品的判别结果。图6(a)为校正集样品交叉验证结果，豆粕中尿素聚合物的含量大于等于0.08%，预测值均大于0.5，偏差均小于0.5;图6(b)为验证集样品的判别结果，判断正确率为100%。因此，采用PLSDA判别方法结合MIR光谱技术识别掺入尿素聚合物的豆粕的检测限为0.08%。

2.2.3 SVM 模型的建立与验证

除去水峰和二氧化碳峰后，对光谱进行变量标准化和一阶导数7点平滑处理，将处理后的光谱数据输入到SVM分类器中，选择径向基作为核函数，得到SVM分类结果。迭代次数432次，支持向量的个数180，边界支持向量的个数0，校正集准确率为100%，验证集准确率为100%。因此，使用SVM方法结合MIR光谱技术识别掺入尿素聚合物的豆粕的检测限为0.08%。

3 讨论

3.1 光谱预处理方法对NIR和MIR模型的影响

预处理对MIR模型的影响较大。方法的种类、组合及组合顺序直接影响MIR模型的预测准确度，采用变量标准化和一阶导数7点平滑组合处理后得到最优结果;预处理对NIR模型的预测准确度没有影响，采用变量标准化处理时，样品预测偏差最小。Devos 等［20］处理 NIR 光谱数据用一步预处理方法，就可以产生一个预测能力较好的SVM模型，而在MIR区，预处理方法及预处理方法的组合顺序对SVM分类模型预测结果均具有很大影响。

图6 校正集(a)和验证集(b)样品PLS-DA模型的判别结果Fig.6 Discriminant results for samples in calibration set(a)and validation set(b)by PLS-DA models

3.2 PLS-DA与SVM方法比较

PLS-DA算法是基于PLS方法建立的类别变量与光谱特征间的线性回归模型，SVM可以将低维线性不可分的样本变量映射到高位空间中，变成线性可分，主要用于解决小样本、非线性问题。本研究中SVM模型略优于PLS-DA，PLS-DA模型得到的未知样品分类结果有预测值偏差，而SVM模型可以直接判断样品分类。Teye等［21］比较了4种模式识别方法(线性判别、K－邻近值、反向神经网络、SVM)，结果表明SVM模型准确度高于其他3种模型，其训练集和预测集的正确识别率均为100%。

3.3 NIR和MIR光谱技术比较

在NIR和MIR区建立的分类模型对掺入尿素聚合物的豆粕最低检测含量分别为1.00%和0.08%，这是由于MIR光谱强度远大于NIR，对样品化学组分的变化比NIR更灵敏，而且尿素聚合物在MIR区的吸光度相对于豆粕较高。Wang等［22］应用NIR/MIR光谱技术鉴别掺假的八角，结果表明，MIR光谱技术准确率优于NIR光谱技术，当两者光谱数据联合建立分类模型时，准确率最高。但在本试验中，MIR光谱技术检测需要用溴化钾压片，光谱采集时间相对于NIR光谱技术稍长，且光谱受到环境和样品中水分的影响更大。

4 结论

①在NIR光谱区，建立的SVM分类模型对掺有1%～5%尿素聚合物的豆粕识别率大于99%;在MIR光谱区，PLS－DA和SVM分类模型对掺假豆粕的识别率为100%，最低检测浓度为0.08%。

②对于鉴别掺有尿素聚合物的豆粕，MIR光谱技术优于NIR光谱技术。

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