顺铂和紫杉醇对CIK细胞杀伤食管癌细胞活性的影响及其分子机制研究*

梅家转 徐虹 刘桂举 赵继智

·基础研究·

顺铂和紫杉醇对CIK细胞杀伤食管癌细胞活性的影响及其分子机制研究*

梅家转 徐虹 刘桂举 赵继智

目的：研究紫杉醇、顺铂对人食管癌EC9706细胞NKG2D配体表达及CIK细胞杀伤活性的影响，探讨相关分子机制。方法：MTT法测定紫杉醇、顺铂对EC9706细胞的24 h半数抑制浓度（IC50）。流式细胞仪检测1/2 IC50浓度紫杉醇、顺铂作用前、后EC9706细胞NKG2D配体的表达。乳酸脱氢酶释放法检测效靶比20：1、30：1时，CIK细胞对1/2 IC50浓度紫杉醇、顺铂作用前、后EC9706细胞的杀伤活性。荧光定量PCR法检测1/2 IC50浓度紫杉醇、顺铂作用EC9706细胞24 h前、后DNA损伤修复基因（ATM、ATR、CHK1、CHK2、P53）表达的变化。结果：紫杉醇、顺铂的24 h半数抑制浓度分别为10、5 μg/mL。1/2 IC50浓度紫杉醇作用24 h后，EC9706细胞MICB、ULBP2、ULBP3表达均明显增强（P＜0.05），MICA、ULBP1表达无显著性变化（P＞0.05）；1/2 IC50浓度顺铂作用24 h后，EC9706细胞MICA、MICB、ULBP2、ULBP3表达均明显增强（P＜0.05），ULBP1表达无显著性变化（P＞0.05）。效靶比20：1、30：1时，CIK细胞对1/2 IC50浓度紫杉醇、顺铂作用后的EC9706细胞的杀伤活性均明显增强（P＜0.05）。1/2 IC50浓度紫杉醇作用24 h后，DNA损伤修复基因表达均无显著性变化（P＞0.05）；1/2 IC50浓度顺铂作用24 h后，ATM、ATR、CHK1、CHK2基因表达均明显增加（P＜0.05），P53基因表达无显著性变化（P＞0.05）。结论：顺铂、紫杉醇均可增强CIK细胞的杀伤活性，其分子机制可能与激活DNA损伤修复基因，进而增加NKG2D配体表达有关。

食管癌 紫杉醇 顺铂 细胞因子诱导的杀伤细胞 NKG2D配体 DNA损伤修复基因

本研究组前期研究［1-2］表明食管癌细胞株及食管癌组织均表达NKG2D（natural-killer group 2，member D）配体，CIK细胞通过NKG2D-NKG2D配体通路对食管癌细胞发挥杀伤作用。提高肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达有助于免疫细胞发挥抗肿瘤作用［3］。研究发现药物通过DNA损伤反应促进肿瘤细胞NKG2D配体的表达，从而激发免疫细胞的抗肿瘤活性［4-5］。紫杉醇（paclitaxel，PTX）、顺铂（cisplatin，DDP）是治疗食管癌最常用的化疗药物。本研究将观察紫杉醇、顺铂对CIK细胞杀伤食管癌EC9706细胞的影响，并探讨其分子机制，为临床开展化疗联合CIK细胞治疗晚期食管癌提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640（美国Gibco公司）；CD3单抗（以色列ProSpec-Tany TechnoGene公司）；FITC-CD4/PE-CD8/ PerCP-CD3、FITC-CD56、PE-NKG2D、FITC-IgG1、PE-IgG1、鼠抗人 MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3单抗和FITC标记山羊抗鼠IgG1二抗（美国R&D公司）；基因重组人白细胞介素2（IL-2，辽宁省卫星生物制品研究所）；干扰素-γ（IFN-γ，上海市克隆生物高技术有限公司）；淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品有限公司）；RNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）；荧光定量PCR试剂盒（美国Life tech⁃nologies公司）；LDH释放试验试剂盒（美国Promega公司）；紫杉醇（海南中化联合制药专业股份有限公司）；顺铂（云南省生物谷灯盏花药业公司）；人食管癌EC9706细胞株（本实验室冻存）。本文符合本院伦理委员会要求。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 用Primer Express 3.0软件设计DNA损伤修复基因（ATM、ATR、CHK1、CHK2、P53）及β-actin基因特异引物（表1），经美国国立生物技术信息中心数据库BLAST验证后，由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

1.2.2 CIK细胞的制备 密度梯度法分离健康人外周血单个核细胞，经淋巴细胞分离液密度离心，生理盐水洗涤获得外周血单个核细胞。用RPMI 1640液调至起始密度5.0×106/mL。加入1 000 U/mL的IFN-γ，放置37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后加入浓度为50 ng/mL的CD3mAb，500 U/mL的IL-2，以后每2～3 d添加IL-2浓度为500 U/mL的新鲜培养基。培养14 d，流式细胞术检测CIK的表型满足CD3+＞90%、CD3+CD8+＞70%、CD3+CD56+＞30%、CD3+CD4+＜30%、NKG2D＞80%用于实验。

1.2.3 EC9706细胞培养 细胞培养基为含10%胎牛血清、100 μ/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640。

1.2.4 MTT法检测PTX、DDP半数抑制浓度（IC50） 取对数生长期EC9706细胞计数并稀释至5×104/mL，接种于96孔板，每孔200 μL，各种药物浓度做3个平行孔，1个空白对照。培养24 h后，分别加入不同浓度梯度的PTX、DDP（表2），培养24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，继续培养4 h，吸去上清，加入DMSO 150 μL。用酶标仪（波长490 nm）检测A值，计算抑制率，分别计算出PTX、DDP的24 h半数抑制浓度（IC50）［6］。

1.2.5 PTX、DDP对EC9706细胞NKG2D配体的影响检测 对数生长期EC9706细胞，以5×104/mL的浓度接种于2个100 mL培养瓶中，培养24 h后，分别加入PTX、DDP，使其终浓度为使其终浓度相当于1/2 IC50，以不加药物组做对照，培养24 h后，收集PTX、DDP处理前、后的EC9706细胞，PBS洗涤，计数细胞，分管。按1 μg/106细胞浓度分别加入MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3单抗，4℃作用30 min，PBS洗涤后再加FITC标记的山羊抗鼠IgG1二抗，4℃孵育30 min，PBS洗涤后上机，以同型IgG1抗体为阴性对照。用流式细胞仪分析1×104细胞中阳性细胞数，计算百分率。为减少误差，重复实验3次。

表1 DNA损伤修复基因及β-actin基因引物序列Table1 Primer sequences of DNA damage repair genes and β-actin

表1 DNA损伤修复基因及β-actin基因引物序列（续表1）Table1 Primer sequences of DNA damage repair genes and β-actin

表2 不同浓度PTX、DDP对EC9706细胞增殖的抑制率影响Table 2 Paclitaxel and cisplatin decreased the viability of EC97065 cell line

1.2.6 CIK细胞杀伤活性测定［7］采用4 h乳酸脱氢酶释放测定法，参照Cytotox96 Non-Radioactive Cytotoxocity Assay实验步骤。取对数生长期EC9706细胞计数并稀释至2×105/mL，接种于96孔板，每孔50 μL。设定效靶比为20：1、30：1，以培养14 d的CIK细胞为效应细胞，加入不同浓度CIK细胞50 μL，按照试剂盒说明，进行4 h乳酸脱氢酶释放实验。酶标仪检测OD值（波长490 nm），分别计算CIK细胞对1/2 IC50浓度PTX、DDP作用24 h前、后的EC9706细胞的杀伤活性。效靶比为20：1时，采用抗NKG2D单抗阻断CIK细胞表面NKG2D受体，同法求出CIK细胞对1/2 IC50PTX、1/2DDP作用24 h后的EC9706细胞杀伤活性；实验重复3次。

1.2.7 荧光定量PCR法检测DNA损伤修复基因表达使用RNA提取试剂盒分别提取1/2 IC50浓度的PTX、DDP作用24 h前后EC9706细胞的RNA，紫外分光光度计检验纯度并定量，将所得RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR反应体系为：SYBRGreenPCRMasterMix（2×）10μL，上游引物（10 mmol/L）0.4 μL，下游引物（10 mmol/L）0.4 μL，cDNA模板1 μL，加水至总体积20 μL。两步法PCR反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火/延伸1 min，共50个循环。采用相对定量法处理数据，以β-actin为内参，Z=2-ΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 10.0统计软件进行分析。数据以x±s表示，两组资料之间的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIK细胞表型

如图1所示，培养14 d后，流式细胞仪测定结果为：CD3+＞90%、CD3+CD8+＞80%、CD3+CD56+＞30%、 CD3+CD4+＜25%、NKG2D＞80%，满足CIK细胞的表型要求。

2.2 PTX、DDP对EC9706细胞的半数抑制浓度

如表2所示，不同浓度的PTX、DDP作用于EC9706细胞24 h，随着浓度的增加，其对肿瘤细胞的抑制作用逐渐增强，PTX、DDP对EC9706细胞的24 h半数抑制浓度（IC50）分别为10、5 μg/mL。

2.3 PTX、DDP作用前、后EC9706细胞表面NKG2D配体表达情况

如图2、表3所示，PTX、DDP处理前EC9706细胞NKG2D配体表达分别为（蓝色曲线代表同型对照单抗，红色表示原发表达）：MICA（27.54±0.90）%、MICB（3.77± 0.90）%、ULBP1（3.18±1.56）%、ULBP2（42.78±0.34）%、ULBP3（4.82±0.49）%。1/2 IC50PTX（黑色曲线）与EC9706细胞共孵育24 h后，EC9706细胞表面MICB、ULBP2、ULBP3表达较作用前明显增强（P＜0.05），MICA、ULBP1无显著性变化；1/2 IC50DDP（绿色曲线）与EC9706细胞共孵育24 h后，EC9706细胞表面MICA、MICB、ULBP2、ULBP3表达明显增强（P＜0.05），ULBP1无显著性变化。

2.4 PTX、DDP作用前、后EC9706细胞对CIK细胞的杀伤敏感性

如表4所示，效靶比分别为20：1、30：1时，1/2 IC50浓度的PTX、DDP作用后较作用前相比，CIK细胞对EC9706细胞的杀伤活性均明显增高，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。效靶比20：1，抗NKG2D单抗阻断CIK细胞表面NKG2D受体后，CIK细胞对1/2 IC50PTX、1/2DDP作用后的EC9706细胞杀伤活性分别为（11.98±1.72）%、（11.26±1.19）%，与作用前相比差异均有统计学意义（P＜0.05），抗NKG2D单抗阻断CIK细胞表面NKG2D受体后，CIK细胞对1/2 IC50浓度的PTX、DDP作用后的EC9706细胞杀伤活性组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 PTX、DDP对DNA损伤修复基因表达的影响

如表5所示，1/2 IC50浓度的顺铂作用24 h后，EC9706细胞的ATM、ATR、CHK1、CHK2基因表达均明显增加（P＜0.05），P53基因表达无显著性变化（P＞0.05）；1/2 IC50浓度的紫杉醇作用24 h后，EC9706细胞的ATM、ATR、CHK1、CHK2、P53基因表达均无明显变化（P＞0.05）。

图1 CIK细胞表型Figure 1 Phenotype of CIK cells

图2 PTX、DDP对EC9706细胞NKG2D配体表达的影响Figure 2 Expression of NKG2D ligands on EC9706 cells before and after treatment with PTX or DDP

表3 1/2 IC50PTX、DDP对EC9706细胞NKG2D配体表达的影响 （%）Table 3 Expression of NKG2D ligands on EC9706 cells before and after treatment with 1/2 IC50PTX or DDP

表4 PTX、DDP作用前、后EC9706细胞对CIK细胞的杀伤敏感性比较 （x±s，%）Table 4 Cytotoxicity of CIK cells against EC9706 cells before and after treatment with PTX or DDP（x±s，%）

表5 PTX、DDP对食管癌EC9706细胞DNA损伤修复基因表达的影响Table 5 Expression of DNA damage repair genes of EC9706 cells before and after treatment with PTX or DDP

3 讨论

化疗和靶向治疗作为晚期肿瘤患者主要治疗方法，其抗肿瘤的分子靶点相对明确。然而化疗和靶向治疗对机体免疫系统的影响及对免疫细胞抗肿瘤活性的影响尚不明确。越来越多体内外研究表明，化疗和靶向治疗影响机体免疫系统的抗肿瘤活性，甚至其体内抗肿瘤效果与患者体内免疫细胞功能密不可分。研究表明赫赛汀治疗HER-2高表达乳腺癌近期效果和远期疗效与患者体内NK细胞的不同功能密切相关［8］。伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病患者的同时，提高患者体内NK细胞表面NKG2D受体表达增强，增强了NK细胞的活性，与伊马替尼共同发挥抗肿瘤作用［9］。新近的研究表明化疗药物吉西他滨能够诱导肿瘤细胞表面NKG2D配体表达，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，吉西他滨联合免疫细胞输注提高了晚期肿瘤患者的远期效果［10］，上述研究结果提示化疗和靶向治疗体内抗肿瘤作用与体内免疫系统的作用密不可分，NKG2D-NKG2D配体系统起关键作用。

NKG2D-NKG2D配体信号通路在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，NKG2D表达在NK细胞、γδT细胞和CD8+T细胞表面，是机体免疫细胞抗肿瘤的主要活化性受体［11］。NKG2D配体包括两大类［11］：MHC-I类链相关分子A或B（MHC class I chain-related molecule A or B：MICA，MICB）及UL16结合蛋白（UL16 binding proteins：ULBP1，ULBP2，ULBP3）。NKG2D配体广泛表达于肿瘤细胞表面，免疫细胞表面NKG2D受体与肿瘤细胞表面NKG2D配体结合，激发抗肿瘤免疫应答。

CIK细胞是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子共同培养一段时间后获得的异质细胞群。该群体细胞表面表达NKG2D受体。CIK细胞对肿瘤细胞杀伤作用依赖NKG2D受体和肿瘤细胞表面NKG2D配体结合，释放穿孔素和颗粒酶发挥抗肿瘤作用［12-13］。NKG2D配体表达于肿瘤细胞表面，是CIK细胞识别肿瘤细胞的重要分子，增加NKG2D配体表达能显著增强CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性［14-15］。研究表明DNA损伤反应能启动DNA损伤修复系统，上调DNA损伤修复相关基因（ATM、ATR、CHK1、CHK2、P53）等表达，进而诱导肿瘤细胞表面NKG2D配体表达，增强免疫细胞的抗肿瘤活性［5］。

化疗是晚期食管癌最主要的治疗手段，PTX、DDP联合化疗是该类患者的标准治疗方案。本研究证实PTX、DDP作用EC9706细胞后，CIK细胞对EC9706细胞的杀伤活性明显提高，表明PTX、DDP提高了EC9706细胞对CIK细胞杀伤的敏感性。进一步对PTX、DDP提高EC9706细胞对CIK细胞杀伤敏感性的机制进行了研究，结果显示PTX、DDP均能提高EC9706细胞表面NKG2D配体的表达。DDP是通过DNA损伤反应上调ATM、ATR、CHK1、CHK2表达发挥作用，而PTX上调NKG2D配体表达作用与DNA损伤反应无关，可能与紫杉醇是细胞有丝分裂抑制剂，不能直接造成DNA损伤有关，相关分子机制有待进一步研究。

临床有多项研究证实，化疗联合自体CIK细胞治疗能够延长肿瘤患者的生存期［10，16］，结合本研究认为紫杉醇、顺铂为主的联合化疗方案可与CIK细胞组成过继性免疫化疗方案，有望成为治疗食管癌的新方法。

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（2015-04-09收稿）

（2015-05-22修回）

（编辑：周晓颖）

梅家转 专业方向为肿瘤的综合治疗。

E-mail：mjzhuan@163.com

2015天津乳腺癌防治研究国际研讨会成功召开

2015年5月由中国抗癌协会、中国抗癌协会乳腺癌专业委员会主办，天津医科大学肿瘤医院承办的2015天津乳腺癌防治研究国际研讨会在天津召开。

此次会议的主题为乳腺癌研究的前沿与方向，会议邀请来自美国、日本、瑞典等国际知名的乳腺癌研究专家，以及包括香港、台湾在内的我国30余个省、市、自治区的乳腺癌领域的研究专家，分别针对乳腺癌基础研究及流行病学、乳腺癌转化医学与分子分型、乳腺癌影像诊断与外科治疗、内分泌治疗、靶向治疗、放射治疗、综合及个体化治疗等方面进行学术交流，旨在传递国际乳腺癌领域最新的研究成果，交流乳腺癌诊断及治疗最新的进展和技术，为广大的乳腺癌医疗工作者提供与该领域国际、国内顶尖专家面对面交流的机会。此次会议的交流及报告代表了世界上最先进的乳腺癌诊治水平，为国内乳腺癌从业医疗人员与国际知名乳腺癌研究专家提供了一个出色的交流合作的平台。

——本刊编辑部

Effect of cisplatin and paclitaxel on the cytotoxicity of cytokine-induced killer cells on esophagus carcinoma and its molecular mechanisms

Jiazhuan MEI,Hong XU,Guiju LIU,Jizhi ZHAO
Department of Oncology,Zhengzhou People's Hospital,Zhengzhou 450003,China
This work was supported by the Science and Technology Program of Henan Province(No.112102310126)

Jiazhuan MEI;E-mail:mjzhuan@163.com

Objective:To explore the effect of paclitaxel(PTX)and cisplatin(DDP)on the expression of NKG2D ligands of human esophagus carcinoma cell EC9706 and on the cytotoxicity of cytokine-induced killer(CIK)cells,as well as to discuss its molecular mechanisms.Methods:The half maximal inhibitory concentration(IC50)values of PTX and DDP against EC9706 cells for 24 h were measured by MTT assay.The expression levels of NKG2D ligands(MICA,MICB,ULBP1,ULBP2,and ULBP3)on the EC9706 cell surface before and after 24 h culture with 1/2 IC50of PTX or DDP were assayed by flow cytometry.Cytotoxicity of CIK cells against EC9706 cells before and after 24 h culture with 1/2 IC50PTX or DDP was analyzed by lactate dehydrogenase release assay at an effector to target cell ratio(E:T)of 20:1 and 30:1,respectively.The expression levels of DNA damage repair genes(ATM,ATR,CHK1, CHK2,and p53)of EC9706 cells before and after 24 h incubation with 1/2 IC50PTX or DDP were detected by quantitative fluorescent PCR.Results:The IC50values of PTX and DDP were 10 and 5 μg/mL,respectively.MICB,ULBP2,and ULBP3 on EC9706 cells were upregulated after 24 h culture with 1/2 IC50PTX(P＜0.05),and the expression levels of MICA,MICB,ULBP2,and ULBP3 were higher after 24 h culture with 1/2 IC50DDP(P＜0.05).Cytotoxicity of CIK cells against EC9706 cells cultured with 1/2 IC50of PTX or DDP at E:T of 20:1 and 30:1 was significantly enhanced compared with those untreated(P＜0.05).The expression levels of DNA damage repair genes did not significantly increase after 24 h treatment with 1/2 IC50PTX(P＞0.05),whereas ATM,ATR,CHK1,and CHK2 were overexpressed after 24 h treatment with 1/2 IC50DDP(P＜0.05).Conclusion:PTX or DDP can enhance the susceptibility of EC9706 cells to CIK cell-mediated lysis by upregulating the expression of NKG2D ligands through activating DNAdamage repair genes.

esophagus carcinoma,paclitaxel,cisplatin,cytokine-induced killer cells,NKG2D ligands,DNAdamage repair genes

10.3969/j.issn.1000-8179.20150396

郑州人民医院肿瘤内科（郑州市450003）

*本文课题受河南省科技计划攻关项目（编号：112102310126）资助

梅家转 mjzhuan@163.com