EphrinA1-PE38／GM-CSF壳聚糖纳米粒治疗荷胶质瘤鼠原位激活树突状细胞研究

李 明陈志民吴中华孙 勇王 斌史锡文韩双印（通讯作者）

郑州大学人民医院 1）神经外科 2）中心实验室 郑州 450003

壳聚糖（chitosan）是从甲壳类生物的贝壳中提取出来的一种可生物降解的多糖，具有良好的生物相容性，对包裹的分子有很好的结合和保护作用，对生物体无毒、相容性好，且很容易制成不同途径给药的基因治疗载体［1］。在表面覆盖吐温-80的纳米微粒，能很好地透过血-脑屏障，对颅内肿瘤治疗具有很好前景。值得注意的是，纳米粒能够用配体进行表面修饰，如抗体片段，可进行靶向治疗。EphA2属于受体酪氨酸激酶家族，EphrinA1是其特异性的配体。在成人各种正常上皮细胞中，EphA2几乎不表达，在能够形成血管的胶质瘤中EphA2高表达明显［2］。以树突状细胞为基础的免疫治疗是一种非常有前景的新疗法，具体做法是使DCs负载肿瘤相关抗原，有效激发机体CTLs的抗肿瘤免疫反应，达到靶向性杀伤肿瘤细胞而不伤害正常细胞的目的。本研究内容主要为高性能壳聚糖包裹EphrinA1结合绿脓杆菌毒素PE38杀伤胶质细胞瘤血管生长造成肿瘤缺血、缺氧性坏死，同时联合免疫调节剂GM-CSF在体内完成DCs抗原负载并产生DCs疫苗。

1 材料与方法

1.1 主要溶液的配制 本实验由郑州大学人民医院伦理委员会批准实施，乙酸溶液的配制：取0.3mL乙酸溶于100 mL消毒去离子水，配制成0.3%，v／v。壳聚糖液的配制：取100mg壳聚糖溶于50mL上述乙酸溶液，配制成0.2%，w／v，用0.22Lm消毒小滤器过滤。

1.2 PE38壳聚糖纳米颗粒制备

1.2.1 PE38壳聚糖溶液的配制：PE38溶于壳聚糖液，以空白壳聚糖液作为对照，在核酸蛋白检测仪测得PE38浓度为2.866mg／mL，2.693A260、2.358A280、A280／A260＜1.5，蛋白 浓 度（mg／mL）＝1.55A280-0.75A260＝1.84mg／mL。

1.2.2 PE38壳聚糖纳米粒的制备：取0.2mL TPP液加入0.5mL PE38壳聚糖液，室温，高速振荡，自动形成乳白色悬液，置于37℃的恒温振荡箱中，反应时间12h，然后使用高速离心机以13 000r·min-1的速度离心30min。采用细胞破碎仪将收集的纳米粒分散到10mL的水中，分批加入过量的硼氢化钠，反应时间10h，得到稳定的NPs。经离心分离、超声分散、透析等处理，将其中的硼氢化钠和STPP去除。取1mL的粒子经冷冻干燥后计算粒子浓度，调节粒子浓度直至达到10mg／mL以备用。

1.3 PE38-NPs的EphrinA1修饰 量取5mL 10mg／mL的NPs，加入到1mL 5mg／mL的EphrinA1溶液中，然后加入25mg的EDC，反应时间1h，即得到EphrinA1修饰的纳米粒。将该粒子溶液于13 000r·min-1转速下离心30min。沉淀重新超声分散后备用。

GM-CSF修饰EphrinA1修饰的NPs：量取2.5mL 10 mg·mL-1EphrinA1修饰的NPs，加入25mg GM-CSF，室温条件下反应时间4h。使用截留分子量14 000的透析袋透析，将未反应的PEG去除，得到PEG和FA修饰的NPs。

粒径和Zeta电位表征：取制备好的NPs以纯水稀释到1 mg·mL-1，然后进行粒径和电位分析。

1.4 荷瘤大鼠模型的构建及干预 成年的C6大鼠购自于河南省实验动物中心，并生长于无菌的饲养环境中。用RPMI-1640和胎牛血清培养C6细胞，当细胞在培养瓶中生长至80%～95%融合时，以0.25%的胰酶消化2～3min，然后采用胎牛血清中止，加PBS液调整细胞悬液密度（1～5）×1010个／mL。在无菌条件下，取0.5mL注射至Wistar大鼠皮层，缓慢注射并留针3min。动物生长10d后模型构建成功，动物随机分为4组：正常对照组（A组，n＝50），生理盐水组（B组，50μg生理盐水，n＝50），口服组（C组，50μg纳米粒，n＝50）和静脉注射组（D组，50μg纳米粒，n＝50），从第10天开始，每3天重复1次相应的处理。

1.5 荷瘤大鼠的生存率的测定 为了解肿瘤生长过程中生长情况，每个时间点处理5只动物，一旦动物处死后，游标卡尺并测量肿瘤的最大直径和最大宽径。

1.6 免疫荧光和免疫组化 第13天时4组动物分别取3只戊巴比妥过量麻醉处死，分离脑组织，4℃多聚甲醛固定24h，放置于20%蔗糖溶液中，当脑组织沉于容器底部，作连续冰冻状片，片厚25μm，每5张片子取一张进行免疫组化或免疫荧光染色，为鉴别肿瘤组织表达的GFAP，常规免疫荧光染色，一抗分别为羊抗GFAP，二抗为兔抗羊IgG-GFP；为计数肿瘤组织血管内皮细胞，常规免疫组化染色，一抗分别为羊抗CD31（1∶200），DAB显色。

1.7 检测引流淋巴结、脾脏中活化DC的比例 （CD11c＋和CD86＋）为检测到活化的树突状细胞，处死大鼠后分别取颈部淋巴结、脾脏组织，剪刀剪碎，碾磨，300目滤网过滤，常规流式细胞仪（FACS Calibur）检测活化引流淋巴结和脾脏中CD11c＋和CD86＋的比例。

1.8 统计学处理 实验所得数据均经SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验（单因素或双因素）或ANOVA（多因素）检验数据，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建质粒真核细胞的表达 制备得到的纳米粒子是一种淡黄色带乳光溶液。虽然制备的纳米粒不是十分规则，但在扫描电镜中观察到粒径均在200nm以下，见图1。

图1 制备的壳聚糖纳米粒电镜照片

EphrinA1、GM-CSF修饰对Zeta电位产生了强烈的影响，EphrinA1、GM-CSF修饰后Zeta电位下降十分明显，见图2。

2.2 肿瘤体积 4组大鼠均无死亡情况发生。随着C6细胞植入时间的延长，肿块组织逐渐增大，倒置显微镜下观察肿瘤细胞生长良好。植入肿瘤细胞至第9天可见，形成约0.5cm3的肿块组织。干预3d后，注射纳米粒组、口服纳米组大鼠的肿瘤体积明显小于其他2组，以后各个时间点此情况更加明显。见图3。

图2 不同修饰后纳米粒电位

图3 不同组肿瘤体积大小

2.3 免疫组化 肿瘤组织GFAP染色阳性，同时可见PE38毒素蛋白分散在血管周围（图4A～C）。部分肿瘤组织细胞核明显萎缩、坏死（图4D），CD31作为肿瘤血管的一个标记物，各组均见CD31呈阳性表现（图4E～H），静脉注射纳米粒组CD31阳性明显减少（图4I）。

2.4 流式细胞仪检测DCs的数量及活化DC的比例 正常对照组、生理盐水组、口服纳米粒组组、静脉注射纳米粒组CD11＋和CD86＋双标术后8d较术前高，以后8、15、22、29d各个时间点，逐步下降，但较其他3组仍较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见图5。

3 讨论

本研究结果显示，壳聚糖包被的EphrinA1-PE38／GMCSF纳米粒能有效杀伤胶质细胞瘤血管生长造成肿瘤的坏死，同时体内促进局部引流淋巴结及脾脏中树突状细胞活化，相当于体内形成原位树突状细胞疫苗。动物实验进一步表明，此纳米粒可有效提高荷瘤动物模型的生存时间。EphrinA1、GM-CSF分子链上没有可以电离的基团，修饰后一般只能使Zeta电位的绝对值下降，表明此纳米粒构建成功。纳米粒能否通过血脑屏障是本实验的一个中心焦点，本实验中，我们可在肿瘤血管周围检测出毒素蛋白，而在其余脑组织及肝肾等组织中尚无检测到，说明经壳聚糖包被的的纳米粒能有效透过血脑屏障［3］，并可以充分发挥其毒素作用。另外，胶质瘤本身可以破坏部分血脑屏障，这也是此纳米粒能有效达到肿瘤周围的一个重要因素。

脑组织是一个免疫特免部位，无完整的淋巴系统和正常的淋巴引流，树突状细胞细胞能否有效杀伤胶质瘤是本次研究顺利进行的一个焦点。传统观点认为，脑组织中缺乏DCs，但只是相对而言，多种病理情况下血-脑屏障受到破坏，淋巴细胞可以进入中枢发挥免疫作用。虽然脑内缺乏结构完整的淋巴管，但脑脊液与颈部淋巴结之间存在联系。且越来越多的证据表明，脑组织中存在DCs或DCs的前体细胞，其可能来源于外周血，也可能由脑组织中的细胞转化而来。我们有理由相信，抗血管治疗脑胶质瘤，不但破坏了“免疫特赦”屏障，同时也激活了潜伏在脑血管周围和蛛网膜下腔起免疫监视作用的T淋巴细胞，通过原位细胞免疫达到了靶向性肿瘤杀灭效应。本次实验证明，经治疗后荷瘤大鼠的颈部淋巴结可通过流式细胞仪双标检测到树突状细胞的标志物（CD11c、CD86＋），分析显示干预前后差异有统计学意义，进一步验证了树突状细胞可以在中枢神经系统发挥作用。

图4 静脉注射组肿瘤组织血管周围分布（A-C），静脉注射组可见肿瘤组织的细胞核皱缩（D），不同组CD31染色阳性的表现（E-H），并细胞计数（I）

图5 不同组活化树突状细胞阳性细胞的计数

［1］Jung WJ，Park RD.Bioproduction of chitooligosaccharides：Present and perspectives［J］.Mar Drugs，2014，12（11）：5 328-5 356.

［2］Miki K，Nagaoka K，Harada M，et al.Combination therapy with dendritic cell vaccine and IL-2encapsulating polymeric micelles enhances intra-tumoral accumulation of antigen-specific CTLs［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（2）：499-504.

［3］Colton CA.Immune heterogeneity in neuroinflammation：dendritic cells in the brain［J］.J Neuroimmune Pharmacol，2013，8（1）：145-162.