载脂蛋白E基因与脑血管淀粉样变对高血压脑出血的影响

罗仁国 印晓鸿 范 杰 段 劼 杨彬彬 唐晓平

川北医学院附属医院神经外科 南充 637000

高血压脑出血（hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH）是一种常见的脑血管病，具有高病死率和致残率等特点，其发生与脑动脉粥样硬化、脑淀粉样变血管病、血液病、动脉瘤等有关。大脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）是由于淀粉样蛋白（其中最常见的是β淀粉样蛋白）在大脑血管壁沉积并不断替代平滑肌层，导致血管壁损害破裂出血及其他血管病变，进而导致脑出血。载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是体内一种十分重要的载脂蛋白，可在血浆胆固醇和甘油三酯的代谢过程中发挥作用，还通过影响β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）在血管壁在沉积，发生CAA。本研究通过对高血压脑出血患者及正常人进行ApoE的多态性分析，并检测Aβ的表达，探讨ApoE及Aβ在高血压脑出血发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2013-06—2014-06我院住院治疗的HICH患者300例，男165例，女135例，平均年龄（48.65±6.74）岁；所有患者均具有详细且完整的病史，排除肾功能不全、肾病综合征、甲状腺疾病、肝硬化以及肿瘤等可能影响血脂蛋白代谢的疾病。对照组为我院体检中心体检的正常成人150例，男82例，女68例，平均年龄（47.78±7.24）岁。

1.2 方法 所有研究对象均隔夜禁食＞12h，次日清晨空腹抽静脉血后并加EDTA抗凝，常规提取DNA、RNA进行ApoE基因多态性检测以及β淀粉样蛋白的半定量检测。取经手术治疗的高血压脑出血患者血肿周围毁损脑组织标本，进行H-E染色及刚果红染色并观察。

1.2.1 ApoE基因检测：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）检测2组ApoE基因。首先，提取基因组DNA，采用PCR法扩增取ApoE基因片段，按照文献［1］对ApoE基因进行分型，分析ApoE的多态性选取ApoE基因包含编码第112位和158位氨基酸的一段基因序列，扩增引物：F4：5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’；F6：5’TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’；扩增产物为244bp，将扩增产物加入限制性内切酶HhaI过夜处理后，产物再用非变性丙烯酰胺凝胶电泳分离、染色显色后观察并拍照。

1.2.2 β淀粉样蛋白前体的半定量检测：β淀粉样蛋白主要由淀粉样B蛋白前体（Aβ16-17）水解产生，参照文献［2］，以人类红细胞β血影蛋白基因为参照模板，为gApp，样本RNA经反转录成cDNA，扩增后称为cApp，对cApp及gApp竞争RT-PCR，计算出gApp及cApp的DNA条带光密度值，求得两光密度值的比值log值，以竞争RT-PCR不同浓度值为X轴，两光密度值得log值为Y轴，作直线回归分析，计算出相对cApp的相对半定量值。

1.2.3 β淀粉样蛋白染色：H-E染色，先固定切片，二甲苯脱水透明，石蜡包埋，乙醇脱蜡染色，苏木精水溶液染色；盐酸酒精与氨水分色；酒精伊红染色液染色；脱水透明；封片后观察。刚果红染色，石蜡包埋，切片脱蜡染色，甲醇刚果红染液染色，碱性乙醇分化液分化至不再褪色，苏木素淡复染细胞核，脱水，透明封片后观察。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，ApoE基因型分布及等位基因频率通过Hardy-Weingerg平衡定律进行群起平衡验证，计量资料采用±s表示，计量资料数据比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑出血组标本观察 CAA主要累及大脑皮质和软脑膜中小动脉及毛细血管。显微镜下可见中小动脉壁及毛细血管壁的中层和外膜有淀粉样物沉积，尤其在邻近外膜的外表面，严重时血管壁中层弹力层消失，进而完全被淀粉物取代。淀粉样沉积物在H-E染色时呈非结晶嗜伊红物质，而用刚果红染色后显微镜下淀粉样物质呈桔红色改变，偏振光显微镜下呈黄绿色双折射光。

2.2 ApoE基因型频率及等位基因频率分布 研究发现，脑出血组基因型频率分布以ε3／ε3、ε3／ε4基因型最多，分别为23.67%、26.33%，而ε4／ε4与ε2／ε4基因型次之，ε2／ε2与ε2／ε3基因型最少。正常对照组ε3／ε3基因型最多，ε4／ε4最少，统计发现脑出血组ε3／ε3、ε4／ε4、ε2／ε4及ε3／ε4基因型与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。研究等位基因频率发现，脑出血组ApoEε2基因较正常对照组增加，但差异无统计学意义（P＞0.05），脑出血组ApoEε3基因（75.33%）较对照组减少（41.83%），差异有统计学意义（P＜0.01），脑出血组ApoEε4基因较正常对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表1 2组ApoE基因型频率 （%）

表2 2组ApoE等位基因频率 （%）

2.3 2组不同apoE等位基因间Aβ表达 研究发现，ApoE基因的不同等位基因对脑出血组Aβ的表达均较对照组增加，其中ε4基因对脑出血组Aβ表达影响最大，为（3.43±0.70）pmol／g，与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。ApoEε3基因对脑出血组Aβ的表达次之，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），ApoEε3基因对脑出血组的Aβ表达最少，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。统计发现，ApoE等位基因间Aβ表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 ApoE等位基因与Aβ16-17水平比较 （±s，pmol／g）

表3 ApoE等位基因与Aβ16-17水平比较 （±s，pmol／g）

注：与对照组比较，＊P＜0.01；ApoE等位基因间比较，P＞0.05

组别 n ε2 ε3 ε 4脑出血组300 3.24±0.52＊3.28 ±0.62 ＊3.32 ±0.61 ＊对照组150 2.42±0.43 3.44±0.54 3.02±0.45

3 讨论

血管淀粉样变高血压脑出血，显微镜下可见血管壁的中层和外膜有淀粉样物沉积，严重时血管壁中层弹力层消失，进而完全被淀粉物取代。淀粉样沉积物在H-E染色时呈非结晶嗜伊红物质，而用刚果红染色后显微镜下淀粉样物质呈桔红色改变，偏振光显微镜下呈黄绿色双折射光。

ApoE基因位于第19号染色体上，同一位基因点上有3个等位基因ε2、ε3、ε4，其编码的蛋白ApoE2、ApoE3、ApoE4［3］，区别在于112位半胱氨酸的和158位的精氨酸，ApoE2两个位点上编码均为半胱氨酸，ApoE4两个位点编码均为精氨酸，而ApoE3则112位为半胱氨酸，158位为精氨酸。ApoE最初于正常人极低密度脂蛋白中发现，在肝脏细胞及内皮细胞合成后分泌至血浆，通过受体中介，主要存在于乳糜微粒、乳糜微粒残基、极低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白中，参与脂蛋白代谢并起重要作用［4］。ApoE4及ApoE3能通过与低密度脂蛋白受体结合，而与升高血浆中胆固醇及低密度脂蛋白相关［5］，ApoE2虽然可与低密度脂蛋白结合，但结合活性很低，从而形成高脂蛋白血症。本研究发现，脑出血组基因型频率分布以ε3／ε3、ε3／ε4基因型最多，ε2／ε2、ε2／ε3基因型最少，通过研究等位基因发现，等位基因ε3表达频率较正常组明显降低，而ε4表达频率较正常组明显升高，等位基因ε较对照组增高，但无显著性差异（P＞0.05），表明等位基因ε4可能为高血压脑出血的危险因子，等位基因ε3可能为高血压脑出血的保护因子，而等位基因ε2对高血压脑出血的作用尚未明确，与江震钦等［6］研究结果相似。

淀粉样脑血管病由于淀粉样蛋白（常为β淀粉样蛋白，Aβ）在大脑血管壁沉积并不断替代平滑肌层，形成血管壁纤维蛋白样坏死，微血管扩张，导致血管壁损害破裂出血［7］。β淀粉样蛋白是由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）蛋白水解作用而产生。研究发现，ApoE能与Aβ结合，进而参与调节淀粉样蛋白的合成，形成稳定复合物，通过对不同等位基因的连接能力对比发现，ApoE4具有很强的连接能力，能促进淀粉样蛋白形成，而沉积于血管壁，与文献［8-10］报道相似。本研究发现，脑出血组ε4基因对脑出血Aβ16-17影响最大，其表达水平最高，而ε3基因能降低脑出血组Aβ16-17的表达，脑出血表达水平显著低于对照组，ε2基因亦能促进脑出血组Aβ16-17的表达。

综上，通过对ApoE的基因型频率分布、不同等位基因频率分布以及APP的研究发现，ApoE能通过影响APP的代谢，使淀粉样蛋白沉积于血管壁，形成血管壁纤维蛋白样坏死，微管扩张，导致血管壁损害破裂出血，其中Apoε4基因对脑出血的影响最大，为脑出血危险因子，而Apoε3基因为脑出血的保护因子，Apoε2基因能影响淀粉样蛋白的代谢而促进脑出血，但其与脑出血的影响无明显相关性，可能与Apoε2基因还可能通过其他途径起保护作用相关，其功能有待进一步研究。虽然ApoE及脑血管淀粉样变对脑出血有影响，但ApoE以及脑血管淀粉样变影响脑出血的机制有待进一步研究。

［1］Hixson JE，Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HHAI［J］.J Lipid Res，1990，31（3）：545-548.

［2］张伟，谭兰，江三多.老年性痴呆中载脂蛋白E与淀粉样β蛋白前体的关系［J］.中国老年学杂志，2007，27（3）：268-270.

［3］Weisgraber KH，Rall SC Jr，Mahley RW.Human E apoprotein heterogeneity.Cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms［J］.J Biol Chem，1981，256（17）：9 077-9 083.

［4］Han X.The role of apolipoprotein E in lipid metabolism in the central nervous system［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61（15）：1 896-1 906.

［5］Lendon CL，Han BH，Salimi K，et al.No effect of apolipoprotein E on neuronal cell death due to excitotoxic and apoptotic agents in vitro and neonatal hypoxic ischaemia in vivo［J］.Eur J Neurosci，2000，12（7）：2 235-2 242.

［6］江震钦，张国忠.载脂蛋白E基因型多态性与青年高血压性脑出血［J］.中国临床康复，2005，9（29）：110-111.

［7］Yamada M，Itoh Y，Suematsu N，et al.Vascular variant of Alzheimer＇s disease characterized by severe plaque-like beta protein angiopathy［J］.Dement Geriatr Cogn Disord，1997，8（3）：163-168.

［8］Reid RT，Sabbagh MN，Thal LJ.Does apolipoprotein E（Apo-E）genotype influence nicotinic receptor binding in Alzheimer＇s disease［J］.J Neural Transm，2001，108（8／9）：1 043-1 050.

［9］Sorli JV，Velert R，Guillen M，et al.Effects of the apolipoprotein E polymorphism on plasma lipid levels and cardiovascular disease risk in a Mediterranean population［J］.Med Clin（Barc），2002，118（15）：569-574.

［10］Hatcher JP，Virley D，Hadingham SJ，et al.The behavioural effect of middle cerebral artery occlusion on apolipoprotein-E deficient mice［J］.Behav Brain Res，2002，131（1／2）：139-149.