群体感应抑制剂控制微生物污染的研究进展

郭文慧，王锦利，周爱莲，林其洋，魏奇，方婷

(福建农林大学食品科学学院，福建福州350002)

许多细菌之间存在交流。它们根据种群密度的改变来调整它们的基因表达。这种现象被称为群体信号感应(quorum sensing，QS)。大量关于群体感应的工作在铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、费氏弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等致命性病原体中展开来阐明群体感应的机制。研究证明，群体感应过程包含信号分子的产生、信号分子在介质中的积累至某一阙值浓度、受体识别信号分子、根据信号－受体复合体的浓度进行大量基因的表达［1］。

群体感应主要存在3种系统。以自体诱导物-1(autoinducer-1，简称AI-1)为信号分子的群体感应系统。在这个系统中，一些革兰氏阳性菌以小肽(autoinducer peptide)作为信号分子;革兰氏阴性菌尤其是一些重要的病原菌通常以高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactonase，AHLs)分子作为信号分子，这些细菌中通常存在lu xI基因或lu xR基因［2］。以自体诱导物-2(autoinducer-2，简称 AI-2)为信号分子的群体感应系统在海洋生物发光细菌哈维氏弧菌中被发现，是最普遍的群体感应系统。该系统信号分子的前体物质为4，5-二羟基-2，3-戊二酮(4，5-dihydroxy-2，3-pentanedione，简称 DPD)。DPD是由S-腺苷高半胱氨酸经两步酶促反应合成的［3］。相似地，在以自体诱导物-3(autoinducer-3，简称 AI-3)为群体感应的细菌细胞内也存在两种激酶。但是，其信号分子还未被准确确定，其结构可能与儿茶酚胺类相似［4］。

近年来，相关研究证明群体感应抑制剂可以调节细菌的群体感应系统，控制细菌生物膜的形成、毒力的产生等代谢过程［5］，从而抑制细菌在物体表面的生长和繁殖，达到控制污染的目的。大量研究在筛选群体感应抑制剂和研究其作用机制中展开。为此，笔者简单概括了自体诱导物确定的方法和理想群体感应抑制剂所需具备的条件，主要介绍了4种有群体感应抑制效用的植物精油，并且总结了多种有效的群体感应抑制剂。

1 自体诱导物的确定

通常使用根癌农杆菌NTL4(pZLR4)和紫色杆菌CV026确定以AHL为信号分子的群体感应系统。根癌农杆菌NTL4(pZLR4)自身不产生AHL分子。当存在外源AHL分子时，其β-半乳糖苷酶活性会被激活，使得培养基中的X-Gal被水解，从而产生蓝色。但是，它对短链的AHL分子不敏感，所以使用紫色杆菌CV026作为报告菌，进行二次检测。紫色杆菌CV026自身不能合成C6-HSL，可通过产生紫色色素报告存在外源的AHL分子，特别是侧链长度为4～8个碳的 AHL 分子［6］。

通过哈维弧菌 MM32(ATCC BAA-1117，luxS，luxN)生物发光筛选以AI-2为信号分子的群体感应系统。这株菌株缺少luxS合酶、luxN蛋白酶和AHL受体，且自身不产生DPD信号。在存在外源诱导物的条件下，群体感应效应可以被测量［7］。

2 理想群体感应抑制剂需具备的条件

设计或寻找理想的群体感应抑制剂需考虑以下因素［8］:①群体感应抑制剂需是低分子质量化合物，这种化合物可以抑制群体感应相关基因的表达;②应对群体感应调节器有很高的特异性;③群体感应抑制剂需对真核宿主无毒;④群体感应抑制剂需不能干扰细菌细胞的基础代谢过程如蛋白质的合成、DNA的代谢、细胞壁的形成，否则会使细菌产生耐药性;⑤群体感应抑制剂的化学性质稳定，对宿主的代谢有一定的抵抗能力，可在宿主中存在充足的时间来发挥其效力。

3 群体感应抑制剂

群体感应抑制剂的强弱依赖于其产生效果的浓度。根据产生的作用和程度，观察抑制剂的效用。

3．1 植物精油抑制剂

3．1．1 锡兰肉桂(Cinnamomum verum)精油。研究表明，肉桂精油有抗群体感应能力，是长链和短链AHL群体感应系统的潜在抑制剂。锡兰肉桂精油的气相质谱－色谱联用结果显示，这种精油的主要成分为反肉桂醛(72．81%)、苯甲醛(12．5%)、丁香油酚(6．57%)。其中，丁香油酚是锡兰肉桂精油中的主要成分之一。研究表明，当丁香油酚与抗生素一起使用于革兰氏阴性菌中展示协同作用。在Polly Soo Xi Ya等［9］研究中，在接种量约为105CFU/ml的细菌培养液中，加入体积比为0．02% 的肉桂精油或体积比为0．02%肉桂精油混合浓度为256μg/ml哌拉西林。每4 h对100μl样本进行可行性计数，持续24 h。通过对比肉桂精油组与肉桂精油和哌拉西林混合使用组，发现肉桂精油对大肠杆菌J53 R1有抗菌活性，并且与哌拉西林有协同效应。另一方面，用肉桂精油处理大肠杆菌［pSB1075］和大肠杆菌［pSB401］，使得这两株大肠杆菌的生物发光表达减少，表明存在群体感应抑制剂的可能性。当肉桂精油的浓度增加时，对大肠杆菌［pSB1075］和大肠杆菌［pSB401］的抑制作用也被提升。因为大肠杆菌［pSB1075］和大肠杆菌［pSB401］分别携带有las R和lux R受体基因，对大肠杆菌［pSB1075］和大肠杆菌［pSB401］产生抑制作用则表明存在抗群体感应活力。

通过使用阴离子洗涤剂SDS作为外膜渗透探针进行外膜渗透试验，发现肉桂精油的主要作用模式为在致死或亚致死浓度破坏细菌膜系统，随后增加抗生素进入细菌细胞的非特异性流动性［10－11］。这些结果表明肉桂精油不仅有透过细胞膜的能力，而且有抗群体感应作用。

3．1．2 牛至(Oregano)精油。牛至精油的抗菌活性在与食源性病源菌相关文章中被广泛报道。Maria等［12］首先将3 g柑橘皮果胶、0．99 ml甘油、不同浓度的牛至精油(0、15．7、25．9 和36．1 mg/ml)溶解于 100 ml水中，并均质 15 min，接着倒入培养皿，在60℃下干燥24 h用于制备牛至精油果胶膜。在LB琼脂板上布涂0．1 ml紫色杆菌(ATCC 12472)接种物;将果胶-牛至精油膜的纸片(0、15．7、25．9、36．1 mg/ml)和直接用牛至精油浸渍的纸片(0、6．25、12．5、25 mg/ml)置于LB板中;然后在30℃下培养24 h。培养后，记录在纸片周围的生长或产色抑制。结果显示，6．25 mg/ml牛至精油、15．7 mg/ml牛至精油果胶纸片即可抑制紫色杆菌(ATCC 12472)产生紫色色素，且随着浓度的提高产色被抑制的效果越明显，当精油浓度超过一定浓度时还可抑制紫色杆菌(ATCC 12472)的生长。紫色杆菌(ATCC 12472)的紫色色素受群体感应系统控制。紫色色素的产生被抑制，表明牛至精油可抑制群体感应系统。

此外，通过量化紫色杆菌(ATCC 12472)色素产生的量，证明牛至精油有抗群体感应活力。其方法为先将紫色杆菌接种于包含不同浓度的牛至精油或果胶－牛至精油膜的LB肉汤中，并且在30℃下培养24 h;再从每个样本中取1 ml培养物，离心，沉淀不溶性紫色杆菌素;将不溶性紫色杆菌素颗粒溶解于1 ml的二甲亚砜中，涡旋直到紫色色素被提取;接着，再次离心去除细胞;在585 nm处测量含紫色色素上清液的OD值，结果表示为紫色色素产物的百分含量。每个试验的对照为不含牛至精油或果胶的LB培养基。对照样本的色素产生设为100%。

Lambert等［13］报道了牛至精油对金黄色酿脓葡萄球菌的最小抑菌浓度为0．575 mg/ml。牛至精油的主要成分为香芹酚。Vattem等［14］曾报道了8 mmo/L的香芹酚可减少紫色杆菌的紫色杆菌素的产生，但不影响细菌的生存能力。试验证明，牛至精油抑制色素产生的原因可能为香芹酚抑制了编码高丝氨酸内酯基因表达。在以前的研究中曾报道了富含3%香芹酚的果胶膜使鸡胸肉中的肠沙门氏菌和大肠杆菌157:H7(4．3～6．8 lg CFU/g)显著减少。这些结果反映低浓度的牛至精油或添加牛至精油的果胶膜作为群体感应抑制剂的可能性。由于精油成分的复杂性，其具体作用机制还有待探寻。大部分研究人员将香芹酚素抑制色素的产生与减少编码高丝氨酸内酯基因的表达联系在一起。他们推测牛至精油作为群体感应抑制剂干扰的群体感应过程为:①信号分子生物合成或高丝氨酸内酯信号受体的抑制;②酶活性被钝化或群体感应分子被生物降解。

3．1．3 阿魏(Ferula asafoetida L．)精油。在 Ehsan 等［14］报道了将25μg/ml阿魏精油加于紫色杆菌的培养物中可完全抑制紫色杆菌产生紫色色素的能力。此外，在铜绿假单胞菌中主要的3种QS系统分别为las、rhl和pqs系统。这3种系统影响铜绿假单胞菌的全基因组序列中6%基因的表达。这6%的基因中绝大多数与细菌特异性密度依赖的行为有关，如胞外多糖的合成、生物膜的形成、群集运动、抗生素的产生。铜绿假单胞菌的绿脓菌素是一个受QS系统控制的因素，主要由las系统调节。通过测量从稳定生长期铜绿假单胞菌中制备的样本在520 nm处的光密度值，发现阿魏精油显著地抑制绿脓菌素产物，表明阿魏精油抑制las系统。也有人提出质疑，认为绿脓菌素产物间接地受到培养基pH或铁浓度的影响。经检测，在整个试验过程中，培养基pH无变化。同时，通过测量样品中的铁载体、弹性蛋白酶、结晶紫在405、495、650 nm处的光密度值，发现阿魏精油使得铜绿假单胞菌的铁载体、弹性蛋白酶产物和生物膜的形成减少［15］。这也说明阿魏精油可作为新型群体感应抑制剂。

3．1．4 白草(Lippia alba)精油。Jesus 等［16］利用紫色杆菌CV026研究了白草中分离的5种精油对其生长的影响和潜在的抗群体感应活力。首先将精油溶解于二甲基亚砜中，然后加入无菌培养基中，使得最终浓度分别为0．01、0．1、10、100、200、300μg/ml，再采用肉汤稀释法测定细胞生长抑制的情况，将等体积的紫色杆菌CV026置于不同浓度的精油和纯二甲基亚砜(对照)中，然后置于30℃下培养18 h，在620 nm处测量其吸光度值。结果显示，相对于溶剂对照组，5种白草精油都显著地抑制了紫色杆菌的生长，并且其中的两种精油的抑菌效果随其浓度的增加更为显著。

另一方面，通过向紫色杆菌CV026外源添加C6-HSL信号分子测试白草精油的抗群体感应能力。首先将过夜培养的紫色杆菌CV026的光密度值(OD620)调整至0．1;从中取出100μl细菌培养液加入到含有890μl的LB介质、5μl的C6-HSL(15 mmol/L)和 5 μl浓度分别为0．01、0．1、10、100、200和300μg/ml精油的无菌离心管中(对照组为加入5μl二甲基亚砜)。最后，包上铝箔，在有氧的情况下培养24 h。研究结果显示，来自白草的两种精油是有效的群体感应抑制剂。其中一种包含最大柠檬醛——橙花醛，另一种包含最大柠檬烯和香芹酮，且这两种精油对细胞生长的抑制作用很小。

采用纸片扩散法在金黄色葡萄球菌ATCC 25923中使用香叶醛/橙花醛型精油，发现10和5μl纯精油可产生最大生长抑制区域。这些数据表明来自白草的精油对金黄色葡萄球菌有抗菌活性，且有望成为群体感应抑制剂［16］。但是，由于白草精油有一种或几种主要的成分和许多种次要成分。因此，这些混合物对群体感应系统的具体作用模式是复杂的。尽管可以推测精油中的主要成分与次要成分之间有协同作用，还需要对其具体作用机制进行更加深入的研究。

3．2 呋喃型 呋喃型群体感应抑制剂活力和其抑制机制已被深入研究。据报导，已从海洋水藻D．pulchra中获得卤化呋喃酮。它们可保护水藻免受海洋细菌的黏附和淤积［17］。天然化合物(5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone也被称为呋喃酮1。研究显示，呋喃酮1在对浮游生物生长无影响的浓度下，可以抑制大肠杆菌聚集和生物膜形成。基于AHL和以自体诱导物2为信号分子的群体感应系统都可被呋喃酮抑制。由于呋喃酮这一类分子与这两种群体感应的信号分子在结构上相似，原先人们认为呋喃酮的抑制机理为与自体诱导物竞争性结合其受体。近年来研究显示，卤化呋喃酮的抑制机理为破坏且促进费氏弧菌和哈维氏弧菌的luxR蛋白的转变。这削弱了luxR与DNA的结合和发起转录的能力。研究证明，呋喃酮4可以提高铜绿假单胞菌生物膜对托普霉素的敏感性。溴化呋喃酮对革兰氏阳性菌和真菌有效［18］。

3．3 群体感应淬灭酶 AHL-内酯酶、AHL-酰基转移酶、对氧磷酶(paraoxonases，PONs)可降解群体感应信号分子。AHL-内酯酶可水解AHL的内酯环，且AHL-内酯酶已从多种细菌代谢产物中分离得到。通过大肠杆菌的功能性克隆确定了AHL-内酯酶由AiiA基因编码。内酯酶是一种金属蛋白，在活性部位有2个金属锌离子。在这种酶中，除锌以外的残基用于维持活性部位构象。AHL酰基转移酶水解AHLs的酰胺结合键，从而降解AHL信号。产物为脂肪酸分子和高丝氨酸内酯。对氧磷酶类可水解AHL信号的高丝氨酸内酯环。对对氧磷酶进行结构研究和诱变研究，发现这3种酶PON1、PON2和PON3显示了重叠的结构特征，但对底物的特异性不同［19］。

3．4 高丝氨酸内酯(homo serine lactone，HSL)类似物 这些分子是群体感应信号分子的类似物，可与信号分子竞争性地结合受体，阻碍群体感应。HSL类似物已被证实可抑制金黄色酿脓葡萄球菌形成生物膜。使用3种群体感应报告菌株根癌农杆菌(含TraR质粒)、铜绿假单胞菌(含LasR质粒)、费氏弧菌(含LuxR质粒)进行AHL数据库筛选。使用基于gfp报告基因构建报告菌株，可构建HSL类似物数据库，同时进行AHL抑制剂的筛选。群体感应抑制剂分子可使gfp报告基因的表达减少50%或更多。使用自体诱导物的局限性在于以下两点:①大多数HSL类似物可与HSL分子竞争性结合受体位点所需的浓度;②可能存在副作用。由于HSLs通常作为免疫抑制剂，HSLs的类似物可能使病人的免疫力降低［20］。

3．5 AI-2的类似物 这些类似物可与QS信号竞争且阻塞内生性QS信号与其受体的结合。AI-2的C-1烷基类似物被报道竞争性与lsrR调节器结合而作为群体感应抑制剂。尽管这些群体感应抑制剂可广泛用于多种细菌，它们仍对一些目标细菌显示出很高的选择性。一些烷基类似物对大肠杆菌有特异性，其中只有丁基-和异丁基-DPD抑制鼠伤寒沙门氏菌的信号分子，尽管来自这两种细菌的lsrR蛋白享有高度的同源性和相似的折叠结构［21］，硼酸和DPD类似物已被用作AI-2的拮抗剂。

3．6 肽和抗体 从金黄色葡萄球菌IV型中合成的小肽以剂量依赖方式抑制金黄色葡萄球菌I型agr基因的表达。相似的，人们设计了一种小肽分子。这种小肽分子对4种类型的金黄色葡萄球菌都可产生作用，以此作为金黄色葡萄球菌的广谱群体感应抑制剂。抑制RNAIII的肽对耐药性葡萄球菌中以agr介导的生物膜形成有抑制作用［22］。群体感应信号的抗体对群体感应过程有阻碍作用。通过接种含AI-1信号分子的疫苗，并由此产生抗体。这种抗体可干扰群体感应，并在小鼠对抗铜绿假单胞菌感染肺部的过程中保护小鼠。

4 展望

近年来大量研究工作在筛选群体感应抑制剂和探索群体感应抑制剂机制中展开，目的是为寻找有效的群体感应抑制剂。现已发现多种来自植物的精油有群体感应抑制效果。来自植物的精油成分天然，更加安全，更易获取，展示在食品行业中控制微生物污染的前景。随着群体感应抑制剂的作用机制被更加深入地研究，在不远的将来更多天然、无毒、有效的群体感应抑制剂将被开发和投入生产，使其成为控制人类、动物和植物病原菌污染的有效选择，并且造福农业、渔业、造纸业等易受微生物污染的行业，发挥其不可替代的作用。

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