重组人内抑素对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

张晓明，余 建，2，黄学应，邓雪飞，李小静

重组人内抑素对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

张晓明1，余 建1，2，黄学应1，邓雪飞1，李小静3

目的观察重组人内抑素（rhEndostatin）对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞（HSFs）增殖的影响，探讨rhEndostatin抑制HSFs增殖的相关机制方法制备兔耳增生性瘢痕（HS）模型，分离、培养并鉴定兔耳HSFs；应用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪分别检测rhEndostatin对HSFs增殖和周期的影响结果分离培养的兔耳细胞经波形蛋白免疫细胞化学染色检测呈阳性。rhEndostatin对HSFs增殖的抑制效应与浓度和作用时间呈依赖关系，测得IC50值为100 mg／L。与正常对照组细胞相比，HSFs G1期细胞比例减少（P＜0．01），S期和G2／M期细胞比例增加（P＜0．01）；与模型组细胞相比，rhEndostatin组细胞G1期比例增加（P＜0．01），S期和G2／M期细胞比例减少（P＜0．01）结论rhEndostatin可抑制兔耳HSFs增殖，该作用可能与其引起HSFs细胞周期G1期阻滞相关。

重组人内抑素；增生性瘢痕；增殖；细胞周期；流式细胞术

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）是皮肤创伤后组织过度修复引起的纤维增生性疾病，术后发病率可达40%～70%，烧伤后则高达91%；临床表现为凸于周围正常皮肤的异常增生，色红或粉红，多伴有瘙痒、疼痛等症状，不仅影响美观，还可发生瘢痕性挛缩，特别是造成关节严重功能障碍，给患者身心健康带来极大危害［1－3］。其组织学特点是成纤维细胞过度增殖，胶原等细胞外基质大量合成、分泌和过度沉积，血管增生［4］。内抑素是从小鼠血管内皮瘤细胞培养上清液中分离出来的一种蛋白质，可特异性抑制新生血管内皮细胞增殖，并诱导其凋亡而发挥抗肿瘤效应［5－7］。前期研究［8］显示，重组人内抑素（recombinant human endostatin，rhEndostatin）可抑制兔耳创面瘢痕增生，减少其血管生成和胶原沉积等。该研究拟在此基础上进一步观察rhEndostatin对增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSFs）增殖的影响，探讨其抗瘢痕增生的作用机制，为临床上HS药物治疗及寻找其治疗新靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验动物 新西兰大耳兔6只，雌雄不限（不含孕兔），2．0～2．5 kg／只，由安徽医科大学实验动物中心提供。

1．1．2 药物与试剂 rhEndostatin注射液（山东先声麦得津生物制药有限公司，批号201201001）；5-氟尿嘧啶（5-FU）（上海旭东海普药业有限公司，批号1201081）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青有限公司）；胰蛋白酶、DMSO、四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Sigma公司）；小鼠抗兔波形蛋白单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；SP试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；细胞周期检测试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）。

1．1．3 仪器 超净工作台（SW-CJ-1F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；CO2培养箱（Shellab 2323，美国SHELLAB公司）；倒置相差显微镜（XDS-1B，重庆光电仪器总公司）；酶联免疫检测仪（ELX800，美国Bio-Tek公司）；流式细胞仪（COULTER EPICS XL-MCL，美国Beckman Coulter公司）。

1．2方法

1．2．1 兔耳HSFs的分离、培养与鉴定 6只新西兰大耳兔分为：正常组（n＝3）、HS模型组（n＝3），单笼单只饲养，兔耳HS模型制备参照本实验室建立的方法进行［8］，每耳2个创面，共计12个。术后第28天处死实验兔，取出兔耳HS组织和正常兔耳真皮组织，超净台内剔除表皮和皮下组织，PBS、DMEM充分漂洗后，用眼科剪将组织块剪成1 mm× 1 mm×1 mm的小块，接种于含10%胎牛血清的培养瓶底壁，置入37℃、5%CO2培养箱中。每3 d更换1次培养液，2～3周后，待原代细胞覆盖瓶底约70%时，用0．25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代培养。实验用传2代细胞。

兔耳HSFs的鉴定采用SP免疫细胞化学法：0．25%胰蛋白酶消化传2代培养的兔耳HSFs，接种于放有盖玻片的6孔培养板中，置入37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。取出盖玻片，PBS漂洗、4%多聚甲醛固定、室温下晾干后按试剂盒说明书操作。一抗为小鼠抗兔波形蛋白单克隆抗体，浓度为1∶100，DAB显色，苏木精复染，光镜下观察并摄片。阴性对照以PBS代替一抗，其余操作同上述步骤。

1．2．2 rhEndostatin对兔耳HSFs增殖的影响 取传2代培养的兔耳HSFs，经0．25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成细胞密度为5×107／L的单细胞悬液，接种于3块96孔培养板中，每孔100 μl，共分6组：6．25、12．5、25、50、100 mg／L rhEndostatin组和空白对照组（加细胞不加药），另设调零组（只加培养液，不加细胞），每组设6个复孔。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，rhEndostatin组细胞加入上述终浓度的rhEndostatin，继续培养24、48、72 h。终止培养前4 h弃去培养液，每孔加入180 μl培养液和20 μl MTT溶液（5 g／L），37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加150 μl DMSO振荡混匀，用酶联免疫检测仪检测波长492 nm下各孔光密度（optical density，OD）值。相对抑制率（%）＝［（对照孔平均OD值－加药孔平均OD值）／对照孔平均OD值］×100%，求接近半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration of a substance，IC50）。实验重复3次，同时观察并记录细胞形态的变化。

1．2．3 rhEndostatin对HSFs周期的影响 取传2代培养的兔耳HSFs和正常兔耳真皮成纤维细胞，用0．25%胰蛋白酶消化，制成2×107／L单细胞悬液，接种于6孔培养板中。实验共分4组：正常对照组、模型组、rhEndostatin组和5-FU对照组，用不含血清的DMEM培养液培养细胞24 h，使细胞周期同步化；弃去培养液，加入完全培养基（rhEndostatin组培养基中含终浓度为100 mg／L的rhEndostatin；5-FU对照组培养基中含终浓度为500 mg／L的5-FU），继续培养48 h后收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期，每组各测3个样本。

1．3 统计学处理采用SPSS 17．0软件进行分析，数据以±s表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2．1 兔耳HSFs的培养与鉴定兔耳HSFs为贴壁细胞，组织块接种后4～6 d可见许多小圆形细胞从其周边游出，7～9 d出现少量长梭形和扁平星形细胞，随着时间的推移，此类细胞逐渐增多并以组织块为中心呈放射状或旋涡状生长排列，16～18 d细胞融合成致密的单层，以长梭形和扁平星形细胞为主，折光性好，其间散在分布有少量圆形细胞。传代培养后，细胞生长速度较原代快，细胞形态也较为均一，呈长梭形并伸出突起。波形蛋白免疫细胞化学染色可见胞质内大量棕黄色颗粒，呈阳性反应，表明原代培养的细胞为HSFs。见图1。

2．2 rhEndostatin对兔耳HSFs增殖能力的影响与空白对照组比较，rhEndostatin（6．25、12．5、25、50、100 mg／L）组作用24 h后，HSFs形态均无明显变化；作用48 h后，仅见50、100 mg／L rhEndostatin组细胞生长缓慢、数量减少、梭状突起回缩、胞体变小、变圆、部分细胞呈单极或不规则形态生长、细胞间空隙变大、极性紊乱、排列不规则、部分细胞脱落悬浮于培养液中；作用72 h后，50、100 mg／L rhEndostatin组细胞数量仍较少，但较48 h稍多。见图2。

MTT结果显示：rhEndostatin对兔耳HSFs增殖的抑制作用与浓度和作用时间呈一定依赖关系。与空白对照组相比，6．25 mg／L rhEndostatin组在各时间段对HSFs增殖的抑制效果均不明显，差异无统计学意义；12．5 mg／L组在作用48 h后对HSFs的增殖有抑制作用，差异有统计学意义（P＜0．05）；随着浓度的增高，rhEndostatin抑制HSFs增殖的作用效果增强（P＜0．01），其中，100 mg／L组作用48 h时抑制作用达到峰值，IC50值为100 mg／L，因此选用浓度为100 mg／L的rhEndostatin用于后续实验。各组作用72 h后，抑制率较48 h减少。见表1、图3。

表1 rhEndostatin对HSFs的生长抑制作用（n＝12，±s）

与空白对照组比较：*P＜0．05，**P＜0．01

组别OD值24 h48 h72 hF值空白对照0．301±0．0400．607±0．0450．666±0．096189．200 rhEndostatin（mg／L）6．250．288±0．0320．576±0．0590．644±0．021541．840 12．50．263±0．0790．503±0．087*0．578±0．095*548．147 250．251±0．035*0．458±0．036**0．516±0．049**349．835 500．228±0．049**0．380±0．042**0．456±0．036**200．961 1000．222±0．031**0．303±0．016**0．394±0．040**156．012

2．3 rhEndostatin对兔耳HSFs细胞周期的影响流式细胞仪检测和分析结果显示：正常对照组兔耳真皮成纤维细胞周期主要停留在G0／G1期，S期和G2／M期细胞较少。与正常对照组相比，模型组HSFs G1期细胞比例减少，S期和G2／M期细胞比例增加，差异有统计学意义（P＜0．01）。rhEndostatin（100 mg／L）作用48 h后，HSFs细胞周期发生明显改变，与模型组细胞相比，G1期细胞比例增加（P＜0．01），高于正常对照组水平（P＜0．01），S期细胞比例减少（P＜0．01），低于正常对照组水平（P＜0．01），G2／M期细胞比例则增高（P＜0．01），并高于正常对照组水平（P＜0．01）。5-FU对照组各期与正常组（G2／M期除外）和模型组相比，差异有统计学意义（P＜0．01）。见表2、图4。

表2 各组HSFs细胞周期分布（n＝12，±s）

与正常对照组比较：**P＜0．01；与模型组比较：＃＃P＜0．01

细胞周期分布（%）正常对照模型rhEndostatin5-FU对照F值G0／G169．61±2．9539．93±3．17**77．90±2．86**＃＃66．38±2．28**＃＃325．25 S 24．30±1．6147．12±1．53**2．80±1．21**＃＃28．76±1．35**＃＃906．42 G2／M5．90±1．3712．90±2．12**19．30±1．65**＃＃4．84±1．23＃＃454．06

3 讨论

HS是整形外科的常见疾病之一，传统的治疗方法如手术切除、硅胶、冷冻疗法、皮质类固醇激素、抗代谢药、免疫抑制剂和放射疗法等，均因易复发或有严重的不良反应而限制了临床应用。近期研究［9］显示成纤维细胞是参与组织修复的主要功能细胞，正常皮肤成纤维细胞与HSFs具有不同的基因表现型、形态特征以及生长特性等，修复过程发生异常可以导致成纤维细胞过度增殖，转化为HSFs，产生过多的胶原等细胞外基质，经过一系列复杂的作用过程，最终导致瘢痕的形成，因此探讨影响HSFs增殖、凋亡的因素，对防治HS具有重要意义。兔耳HS模型是目前较为成熟的动物模型之一［10］，本研究通过体外培养兔耳HSFs，观察rhEndostatin对HSFs增殖和周期的影响，探讨其作用机制。

rhEndostatin目前主要用于抗肿瘤治疗，除可特异性抑制新生血管内皮细胞增殖、诱导其凋亡外，还可直接抑制部分肿瘤细胞增殖、迁移并诱导其凋亡［11－13］。近年研究［14］显示，rhEndostatin对某些组织过度增生性疾病，如佐剂性关节炎大鼠模型等有治疗作用，可直接抑制成纤维样滑膜细胞的增殖，并诱导其凋亡。本研究显示rhEndostatin对兔耳HSFs的增殖抑制作用与rhEndostatin的浓度和作用时间呈正相关。在48 h内，随着药物浓度的增高，作用时间的延长，增殖抑制作用越明显，这与形态学观察结果是一致的。超过48 h则作用减弱，可能与药物浓度的衰减有关。

MTT结果表明rhEndostatin能抑制兔耳HSFs的生长，推测rhEndostatin能导致兔耳HSFs周期阻滞。细胞周期中存在两个关键调控点，一个是调控DNA复制开始的G1／S转换期，另一个是有丝分裂和细胞分化前的G2／M期。进一步通过流式细胞仪检测细胞周期，结果显示，与正常组相比，HS模型组G1期比例明显减少，S期和G2／M期细胞比例增加，表明HS模型组成纤维细胞增殖活跃；100 mg／L rhEndostatin作用48 h后，HSFs细胞周期发生显著改变，和模型组相比，G1期细胞增多，高于正常组水平，S期细胞比例下降，低于正常组水平，差异有统计学意义。以上结果提示rhEndostatin抑制HSFs增殖的机制可能与细胞周期受阻有关，G1期细胞不能通过周期检测点进入S期而发生G0／G1期阻滞，阻断DNA合成，干扰HSFs周期正常进行，进而发挥抑制效应，与相关研究［14］结果一致。

综上所述，rhEndostatin可抑制兔耳HSFs的增殖，其作用可能通过周期阻滞，抑制G1／S期转换，干扰细胞周期调控而达到抑制增殖的目的。该课题为HS的临床治疗提供了实验依据，但rhEndostatin抑制HSFs增殖的机制并未完全阐明，其相关的分子机制还有待于进一步深入研究。

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Effects of recombinant human endostatin on the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts derived from rabbit ears in vitro

Zhang Xiaoming1，Yu Jian1，2，Huang Xueying1，et al
（1Dept of Anatomy，Anhui Medical University，Hefei 230032；2The First People’s Hospital of Yichang，Yichang 443000）

ObjectiveTo observe the effects of recombinant human endostatin（rhEndostatin）on the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts（HSFs）derived from rabbit ears，and to explore the related mechanism of rhEndostatin inhibiting HSFs proliferation．Methods To establish the model of hypertrophic scar in rabbit ears，and isolate，culture and identify HSFs of rabbit ears；MTT assay and flow cytometry were used to detect respectively the effects on proliferation and cell cycle of HSFs affected by rhEndostatin．Results The cells stained positive for vimentin．rhEndostatin inhibited HSFs proliferation in a concentration-and time-dependent manner，and IC50values measured for the 100 mg／L．The percentage of cells in G1phase in HSFs decreased（P＜0．01），and the rate of cells in S and G2／M phase increased（P＜0．01），compared with that in normal control groups．The percentage of cells in G1phase in HSFs treated with rhEndostatin increased（P＜0．01），and the rate of cells in S and G2／M phase decreased（P＜0．01），compared with that in model groups．Conclusion RhEndostatin can inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts derived from rabbit ears in vitro，which may be related with the G1phase retardation in HSFs．

recombinant human endostatin；hypertrophic scar；proliferation；cell cycle；flow cytometry

R 587．1；R 737．9

A

1000－1492（2015）03－0264－05

2014－11－13接收

国家自然科学基金（编号：81171819、81272107）；安徽高

校省级自然科学研究项目（编号：KJ2012Z166）

1安徽医科大学人体解剖学教研室，合肥 230032

2湖北省宜昌市第一人民医院，宜昌 443000

3安徽医科大学第一附属医院整形外科，合肥 230022

张晓明，男，硕士，讲师；黄学应，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：hxy8676＠126．com