亚硝基乙酰青霉胺对腺样囊性癌细胞VEGF表达双向调控作用

2015-12-17

交通医学 2015年1期

陈锦*，袁苏健

（长江航运总医院•武汉脑科医院口腔科，湖北430015）

[摘要]目的：观察亚硝基乙酰青霉胺（SNAP）对腺样囊性癌细胞中VEGF表达水平的调控作用。方法：将31.25μmol/L、62.25μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L不同浓度的SNAP作用于ACC-M和ACC-2细胞，或用浓度为100ng/mL的LPS预刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分别刺激ACCs细胞0、1、2、4小时。采用CCK-8活细胞计数试剂盒对ACCs细胞进行毒性分析，半定量RT-PCR检测各组细胞中VEGF表达水平。结果：（1）在0μmol/L～500μmol/L浓度的SNAP作用下，细胞活力均保持在88%；用500μmol/L的SNAP分别作用不同时间ACC-M和ACC-2细胞活力，其活力均保持在86%。（2）当SNAP的刺激浓度在31.25μmol/L时能显著上调VEGF的表达，而500μmol/L的SNAP则显著下调ACCs细胞中VEGF的mRNA水平（P＜0.01），仅为基础mRNA水平的0.23倍和0.17倍。结论：在涎腺腺样囊性癌细胞中亚硝基乙酰青霉胺对血管内皮生长因子的表达存在着双向调控作用。

[关键词]腺样囊性癌细胞；一氧化氮；亚硝基乙酰青霉胺；血管内皮生长因子；逆转录聚合酶链反应

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一个多效性的调节因子，在不同的生物学过程中发挥着重要的作用，如促进血管舒张、神经传递、巨噬细胞介导的免疫效应以及肿瘤的发生等。亚硝基乙酰青霉胺（S-nitroso-N-acetyl-penicillamine，SNAP），是目前研究较多、作用较强的NO供体，在溶液状态下能迅速代谢释放出NO。本实验拟用不同浓度的SNAP溶液刺激涎腺腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma of salivary gland，ACCs），检测细胞中VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达水平。研究不同浓度的SNAP对ACCs细胞中血管发生相关因子表达的影响，对进一步了解ACCs中血管发生因子的调控关系，以及探讨血管发生的阻断有着重要的意义。

1　材料和方法

1.1细胞培养将涎腺腺样囊性癌细胞ACC-M和ACC-2细胞（武汉大学典型生物保藏中心）分别培养于6孔板中。待细胞长至1×106密度时，分别加入0μmol/L、31.25μmol/L M、62.25μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L的SNAP作用4h（SNAP的半衰期）。待细胞长至1×106密度时，用浓度为100ng/mL的LPS预刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分别刺激细胞0、1、2、4h。然后用于提取RNA、蛋白或免疫荧光染色。以上实验均有3次有效重复。1.2细胞毒性活力分析用CCK-8活细胞计数试剂盒对不同时间和浓度作用下ACCs细胞进行毒性分析，通过每孔吸光度计算细胞活力。计算方法：细胞毒性活力（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）]×100。以上实验均有3次有效重复，所得结果取平均值。

1.3半定量RT-PCR检测VEGF的表达提取RNA方法如下：将50mL细胞培养瓶中细胞达到80%融合时，倒掉培养液，加入1mL Trizol。将培养瓶内Trizol吸取至1mL EP管中，室温静置5min。加入200μL氯仿，剧烈摇晃数次，室温静置5min，11000 转/分，4℃离心15min。取上清液加入新1mL EP管中，加入500μL异丙醇后摇晃数次。室温静置10min，11000转/分，4℃离心10min。弃上清液加1mL 75%乙醇后混匀。7500转/分，4℃离心5min。弃上清液风干，加入20μL无RNA酶水，58℃加温10min，-70℃冻存。将mRNA逆转录成cDNA，50μL反应体系PCR反应。

VEGF（682 bp）引物序列：5'ggc tctaga tcg ggc ctc cga aac cat3'和5'ggc tct aga gcg cag agt ctcctc ttc3'；β-actin（434 bp）引物序列：5'tgt gcc cat cta cga ggg gta tgc3'和5'ggt aca tgg tgg tgc cgc cag aca3'。

反应条件：95°C变性，30s；VEGF 63.5°C退火，27循环，45s；或β-actin 57°C退火，25循环，30s；72°C延伸30s。收集PCR产物1.5%琼脂糖电泳。凝胶成像系统半定量分析。以上结果均重复3次。

1.4统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行统计处理，计量指标用（±s）表示，ANOVA方差分析，student-Newman-Keuls检验，方差齐性检验进行显著性检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结　果

2.1细胞毒性活力检测ACC-M和ACC-2细胞在不同浓度的SNAP作用4h后细胞的活力，在0μmol/ L～500μmol/L浓度的SNAP作用下，细胞的活力均保持在88%以上（表1）。经浓度100ng/mL的LPS预刺激12h后，用500μmol/L的SNAP分别作用不同时间ACC-M和ACC-2细胞活力，其活力均保持在86%以上（表2）。

表1　不同浓度SNAP刺激下ACC-M和ACC-2活细胞活力（±s，%）

0μmol/L　31.25μmol/L　62.5μmol/L　125μmol/L　250μmol/L　500μmol/L ACC-M　92.7±0.13　91.6±0.21　90.3±0.17　92.6±0.11　88.4±0.26　89.7±0.09 ACC-2　93.6±0.22　90.2±0.14　91.5±0.31　89.4±0.12　91.2±0.07　88.1±0.14

表2　经500μmol/L SNAP作用不同时间后ACC-M和ACC-2活细胞活力（±s，%）

0h　1h　2h　4h ACC-M　89.2±0.26　86.3±0.08　88.6±0.15　87.8±0.12 ACC-2　90.2±0.19　89.9±0.23　86.4±0.31　86.5±0.27

2.2不同浓度SNAP对ACCs细胞中VEGF的mRNA表达水平的影响半定量RT－PCR的结果表明（图1、图2），在31.25μmol/L SNAP刺激下ACCM和ACC-2细胞中VEGF的mRNA平均水平显著升高，为2.32±0.10和2.14±0.15，分别是对照组细胞（0μmol/L）mRNA水平的4.14倍和6.90倍，差异有统计学意（P＜0.01）。随着SNAP刺激浓度升高，mRNA水平逐渐回落：62.5μmol/L SNAP仍可明显上调VEGF的mRNA水平（P＜0.01），但不及31.25μmol/L 的SNAP显著；125μmol/L和250μmol/L SNAP对VEGF mRNA影响差异无统计学意义；而500μmol/L SNAP则显著下调ACCs细胞中VEGF的mRNA水平（P＜0.01），仅为基础mRNA水平的0.23倍和0.17倍（表3）。One－Way ANOVA检验和Student–Newman-Keuls检验比较31.25μmol/L、62.5μmol/L 及500μmol/L浓度组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1　31.25μmol/L SNAP刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA RT－PCR的表达结果

图2　不同浓度SNAP刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA半定量RT－PCR的表达结果

表3　不同浓度SNAP刺激下VEGF的mRNA表达水平（±s）

注：*P＜0.05，ANOVA、Student-Newman-Keuls检验

0 31.25μmol/L　62.5μmol/L　125μmol/L　250μmol/L　500μmol/L ACC-M　0.56±0.03　2.32±0.10*　1.51±0.20*　0.86±0.12　0.42±0.02　0.13±0.02*ACC-2　0.31±0.01　2.14±0.09*　1.35±0.01*　0.66±0.06　0.24±0.06　0.05±0.02*

2.3SNAP时间依赖性抑制100 ng/mL LPS诱导的VEGF的表达水平随着500μmol/L SNAP作用时间的延长，ACCs细胞中LPS诱导的VEGF mRNA水平显著下降（P＜0.01）；当500μmol/LSNAP作用4h后，仅可检测到极微弱的VEGF mRNA条带，其mRNA的平均表达水平显著低于LPS诱导12h后SNAP作用0小时组的mRNA水平（表4）。半定量RT－PCR的结果（见图3、图4）。One－Way ANOVA检验和Student-Newman-Keuls检验比较其他各时间组与0对照组mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4　500μmol/L SNAP刺激不同时间，VEGF和iNOS的mRNA表达水平（±s）

注：*P＜0.05，ANOVA、Student-Newman-Keuls检验

0h　1h　2h　4h ACC-M　2.60±0.08 1.34±0.10*0.47±0.07*0.13±0.02*ACC-2　2.14±0.09 1.20±0.04*0.30±0.04*0.04±0.01*

图3　500μmol/L SNAP刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA RT－PCR的表达结果

图4　500μmol/L SNAP不同时间刺激下ACC-M和ACC-2细胞中VEGF的mRNA半定量RT－PCR的表达结果

3　讨　论

一氧化氮（NO）是一种极不稳定的生物自由基，其生成依赖于细胞内的一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase enzyme，NOS）。它能通过传递电子的反应参与机体的氧化还原反应，在生物体内发挥重要生理作用[2]。目前越来越多的研究证实，NO在肿瘤细胞中发挥着双向调节的作用。研究发现，肿瘤微血管内皮细胞和肿瘤基质细胞中NOS的高表达，能抑制肿瘤的生长和局部浸润[3-4]。而另一些研究表明，NO具有促进肿瘤血管发生和局部侵袭性[5-6]。不同的NO浓度是其在肿瘤调控中发挥着截然相反作用的主要原因。高浓度的NO在生物体内形成过氧亚硝基（OONO-）和N3O2，能氧化或硝化DNA导致DNA单链断裂、抑制DNA的合成以及核苷酸还原酶的活性，并能抑制体内的磷酸化信号通路的活化促进肿瘤细胞的凋亡[1]。而低浓度的NO被证实与肿瘤微血管发生、肿瘤浸润和转移相关[7]。因此将NO作为肿瘤治疗的重要手段的同时，应充分认识低浓度的NO对肿瘤促进作用。本实验证明NO的供体SNAP对ACCs细胞有着双向调控作用，当SNAP的刺激浓度在31.25μmol/L时能显著上调血管发生相关因子的表达，而当SNAP的刺激浓度在500μmol/L时血管发生相关因子的表达被有效抑制。

大量研究证明，NO诱导的血管发生相关因子的异常表达，在促进肿瘤微血管发生方面发挥着重要的作用。Jenkins等[8]首次报道在人肿瘤细胞中，转入iNOS cDNA阅读框后肿瘤生长加速，且伴随着大量微血管的发生。Ambs等[9]的实验证实，在异种种植瘤内NO能诱导VEGF表达增高，促进肿瘤微血管发生。可见在ACC中，相对低浓度的NO可能通过上调VEGF表达来促进肿瘤微血管发生。

随着对NO的抗肿瘤特性研究的逐渐深入，NO被视为一种颇具前景的肿瘤细胞杀伤因子，然而NO对肿瘤调控的双向效应增加了其作为抗肿瘤药物的复杂性[10-11]。因此研究不同浓度NO对ACCs细胞的调控作用和调控途径，将更加有利于研究其对ACCs的抑制作用。本实验结果发现，当SNAP浓度为31.25μmol/L时，ACCs细胞中VEGF表达显著增高。当SNAP浓度为500μmol/L时，LPS诱导的VEGF的高表达被明显抑制，且具有时间依赖性。提示500μmol/L SNAP能有效抑制ACCs血管发生相关因子的表达，提示高浓度NO可能在抑制ACCs血管发生过程中发挥着重要的作用。

[参考文献]

[1] Xu W，Liu LZ，Loizidou M，et al. The role of nitric oxide in cancer［J］. Cell Research，2002，12（5-6）：311-320.

[2] Moncada S，Palmer RM，Higgs EA. Nitric oxide:physiology，pathophysiology，and pharmacology［J］.Pharmacol Rev，1991，43（2）：109-142.

[3] Coskun U，Gunel N，Sancak B，et al. Effect of tamoxifen on serum IL-18，vascular endothelial growth factor and nitric oxide activities in breast carcinoma patients［J］. Clin Exp Immunol，2004，137（3）：546-551.

[4] Jadeski LC，Chakraborty C，Lala PK. Role of nitric oxide in tumour progression with special reference to a murine breast cancer model［J］. Can J Physiol Pharmacol，2002，80（2）：125-135.

[5] Jenkins DC，Charles IG，Thomsen LL，et al. Roles of nitric oxide in tumor growth［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（10）：4392-4396.

[6] Ambs S，Merriam WG，Ogunfusika MO，et al. p53 and vascular endothelial growth factor regulate tumor growth of NOS2-expressing human carcinoma cells［J］.Nat Med，1998，4（12）：1371-1376.

[7] Cheng H，Wang L，Mollica M，et al. Nitric oxide in cancer metastasis［J］.Cancer Lett，2014，Jul 29. pii: S0304-3835 （14）00351 -6. doi: 10.1016/j.canlet.2014.07.014. [Epub ahead of print]

[8] Kielbik M，Szulc I，Brzezinska M，et al. Nitric oxide donors reduce the invasion ability of ovarian cancer cells in vitro ［J］.Anticancer Drugs，2014，Jul 17. [Epub ahead of print]

•综述•

The effect of S-nitroso-N-acetyl-penicillamine (SNAP) on regulation of VEGF mRNA level in Adenoid cystic carcinoma of slavery gland tumor (ACCs) cells

CHEN Jin，YUAN Sujian

（Department of Stomatology，General Hospital of the Yangtze River Shipping；Wuhan Brain Hospital，Hubei 430015）

[Abstract]Objective：To observe the effect of S-nitroso-N-acetyl-penicillamine（SNAP）on the regulation of VEGF mRNA levels in Adenoid cystic carcinoma of slavery gland tumor（ACCs）cells. Method: A concentration gradient of SNAP （31.25μmol/L、62.25μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L）was used to stimulate ACC-M and ACC-2 cells to identify the expression curve of VEGF mRNA levels. Then，after pretreated with 100ng/ml LPS for 12 hours，the ACCs cells were stimulated by 500μmol/L SNAP on 0，1，2，and 4 hours，respectively. Cell Counting Kit-8（CCK-8）was used to analyze the toxicity of SNAP on ACCs cells，and semi-quantitative RT-PCR was used to detect the VEGF mRNA levels. Results：SNAP significantly increased the VEGF mRNA level in the concentration of 31.25μmol/L，while effectively suppressed the VEGF mRNA level in the concentration of 500μmol/L on a time dependent manner. Conclusion：It was suggested that SNAP might exhibit bidirectional regulation function on modulating VEGF expression in ACCs cells.

[Key words]adenoid cystic carcinoma of slavery gland tumor cells；nitric oxide；S-nitroso-N-acetyl-penicillamine；vascular endothelial growth factor；reverse transcriptate polymerase chair reaction

[收稿日期]2014-06-19

* [作者简介]陈锦，女，汉族，湖北武汉人，生于1978年1月，本科，副主任医师。研究方向：牙体牙髓。

[文章编号]1006-2440（2015）01-0024-04

[文献标志码]A

[中图分类号]R730.261