复合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究

陈炼红，张梦苑，伍 红，孙 青，李 键

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学外国语学院，四川 成都 610041；

3.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

摘 要:确定了复合酶(纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶)提取蕨麻多糖的最佳工艺，并对其体外抗氧化活性进行初步研究.在单因素试验的基础上，设计L9(33)正交实验和L9(34)正交实验，分别得出复合酶的最佳配比和复合酶法提取蕨麻多糖的最佳提取工艺条件；采用清除·OH(羟基)自由基模型和O2一·(超氧阴离子)自由基模型评价了蕨麻多糖的抗氧化能力.结果表明:复合酶的最佳配比为:纤维素酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，果胶酶2.0%；最佳工艺条件为:料液比为1:30、pH值为4.5，温度为45℃，酶解时间为60min，此时蕨麻多糖的提取率最大为8.12%，同时验证性实验也表明优化得到的提取工艺稳定可靠；蕨麻多糖对羟基自由基和超氧阴离子都具有较强的清除作用，并与浓度呈一定依赖关系，且对羟自由基的清除能力要比超氧阴离子自由基的清除能力强.

关键词:复合酶；蕨麻多糖；抗氧化

中图分类号:TS201.2；TS218 文献标志码:A 文章编号:2095-4271(2015)04-0407-05

复合酶法提取蕨麻多糖及其抗氧化活性研究

陈炼红1，张梦苑1，伍 红1，孙 青2，李 键3

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学外国语学院，四川 成都 610041；

3.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041)

摘 要:确定了复合酶(纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶)提取蕨麻多糖的最佳工艺，并对其体外抗氧化活性进行初步研究.在单因素试验的基础上，设计L9(33)正交实验和L9(34)正交实验，分别得出复合酶的最佳配比和复合酶法提取蕨麻多糖的最佳提取工艺条件；采用清除·OH(羟基)自由基模型和O2一·(超氧阴离子)自由基模型评价了蕨麻多糖的抗氧化能力.结果表明:复合酶的最佳配比为:纤维素酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，果胶酶2.0%；最佳工艺条件为:料液比为1:30、pH值为4.5，温度为45℃，酶解时间为60min，此时蕨麻多糖的提取率最大为8.12%，同时验证性实验也表明优化得到的提取工艺稳定可靠；蕨麻多糖对羟基自由基和超氧阴离子都具有较强的清除作用，并与浓度呈一定依赖关系，且对羟自由基的清除能力要比超氧阴离子自由基的清除能力强.

关键词:复合酶；蕨麻多糖；抗氧化

中图分类号:TS201.2；TS218 文献标志码:A 文章编号:2095-4271(2015)04-0407-05

多糖(Polysaccharide)具有免疫调节、止血抑菌、抗疲劳等多种生理药理作用[1-2]，有着广阔的应用前景.蕨麻又名人参果，属于高原高寒地区生长的植物，藏医称“卓老沙僧”[3]，是一种理想的食药两用品[4].蕨麻多糖作为一种具有生物活性的食品功能因子，近年来已引起研究人员的关注.目前，对蕨麻多糖提取工艺的研究主要集中在水提法以及醇提法[5-7]，并未见复合酶法提取工艺优化的系统报道.本试验采用复合酶法提取[8-10]，优化提取工艺，并对其体外抗氧化活性进行初步研究，从而为进一步研究蕨麻多糖的生物活性及在食品中的应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蕨麻(Potentilla anserina):秋季，采自四川巴塘草原.

纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶(均购于成都成华区怡语化学实验设备经营部).

无水乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸、葡萄糖、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、水杨酸、硫酸亚铁(均为分析纯，购于成都迪康生物技术有限公司).

1.2 仪器

Delta320型pH计(Mettler-Toledo Group)；WFZ UV-2102PSC型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Centrifuge 5804型离心机(德国Eppendorf公司)；RE-85Z旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)；PL303分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；AKHL-III-24超纯水机(成都康宁试验专用纯水设备厂).

1.3 试验步骤

1.3.1 复合酶法提取蕨麻多糖的工艺流程

蕨麻→烘干→粉碎(过100目筛)→复合酶水解→离心(4000r/min、15min)→取上清液→真空浓缩→醇沉→离心→洗涤→干燥→称重[11-12]

1.3.2 蕨麻多糖含量的测定

采用苯酚硫酸法对蕨麻多糖含量进行测定[13]. 1.3.3 单因素实验

依据参考文献确定复合酶为纤维素酶2.0%、果胶酶1.5%和木瓜蛋白酶1.5%[14]，在复合酶的配比一定的条件下，分别考察不同料液比(g/ml)、pH值、酶解温度和提取时间对蕨麻多糖提取率的影响.

1.3.4 蕨麻多糖的复合酶配比及提取工艺的正交实验

1)复合酶配比对蕨麻多糖的影响

设计L9(33)正交实验，见表1，确定复合酶的最佳配比.

表1 蕨麻多糖复合酶配比正交试验因素水平表Table 1 Complex enzyme factors level table of orthogonal test

2)提取工艺优化

设计L9(34)正交实验，见表2，确定最佳提取工艺[15-16].

表2 提取工艺正交因素水平表Table 2 The orthogonal factor level table of extraction process

1.3.5 蕨麻多糖体外抗氧化活性研究

1)测定超氧阴离子自由基清除率

取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH8.2)和2ml蕨麻多糖提取液于试管中，混匀后于室温条件下静置4min，然后于325nm处测定吸光度，记作A0；取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，立即加入1ml 3mmol/L邻苯三酚并开始计时，在紫外分光光度计325nm处记录第100s时的吸光值，记作A2；按照上述方法，取4.5ml 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液和1ml蕨麻多糖提取液，放置4min后加入1ml邻苯三酚(3mmol/L)，计时，以10mmol/L HCl作为对照，在紫外分光光度计325nm处记录第100s时的吸光度[17-18]，记作A1.

按式(1)计算蕨麻多糖清除超氧阴离子自由基清除率:

清除率(%)＝[1-(A1-A0)/A2]×100%(1)

2)测定羟自由基清除率

将蕨麻多糖用蒸馏水配成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/ml的溶液，取2ml不同浓度的蕨麻多糖溶液，依次加入2ml 6mmol/L的FeSO4溶液、2ml 6mmol/L的H2O2，静置10min，再加入6mmol/L的水杨酸溶液2ml，混匀后在室温下静置30min，于510nm处测其吸光值A1，然后用双蒸水代替水杨酸测定吸光值记作A2，其中空白组用超纯水代替多糖溶液，测定吸光值[19-20]，记作A0.

按下列式(2)计算蕨麻多糖清除羟自由基清除率:

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同料液比对蕨麻多糖得率的影响

图1 料液比对蕨麻多糖得率的影响Fig.1 The effect of the material-water ratio onthe extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

由图1可知，当料液比小于1:20时，随着料液比的增加，蕨麻多糖的得率逐渐增加；当料液比大于1: 20时，随着料液比的增加，蕨麻多糖的得率反而减少；料液比为1:20时，蕨麻多糖的得率最大，说明此时的料液比使蕨麻的溶解性达到最大.因此，通过试验结果可知当料液比为1:20时，最有助于蕨麻多糖溶液的提取，所以最佳料液比为1:20.

图2 不同pH对蕨麻多糖得率的影响Fig.2 The effect of pH on the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

2.1.2 不同pH值对蕨麻多糖得率的影响pH的增加，蕨麻多糖的得率也呈增加的趋势，但当pH值大于4.5时，多糖得率呈减少的趋势，说明pH值超出一定范围后，酶的活性受到了影响，而pH值为4.5时蕨麻多糖的得率最大.pH值对酶活性的影响可通过改变酶的空间结构，使酶失活，从而影响复合酶法蕨麻多糖的得率.

2.1.3 不同酶解时间对蕨麻多糖得率的影响

图3 酶解时间对蕨麻多糖得率的影响Fig.3 The effect of hydrolysis time on the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

酶解时间对蕨麻多糖得率的影响呈倒“U”形，当酶解时间为80min时，蕨麻多糖的得率达到最大值，说明酶发挥了最大的作用，且蕨麻中多糖的得率最大.当酶解时间少于80min时，三种酶各自发挥作用，

互相影响少，当时间超过80min时，三种酶会相互作用，相互影响，反而对蕨麻中多糖的得率起反作用，使得蕨麻多糖得率降低.

2.1.4 不同酶解温度对蕨麻多糖得率的影响

图4 酶解温度对蕨麻多糖得率的影响Fig.4 The effect of hydrolysis temperature on the extraction efficiency of Potentilla anserina polysaccharide

实验表明:当酶解温度为45℃时效果最好.当温度低于45℃时，得率随温度的升高呈逐渐增大的趋势；当温度高于45℃，得率随温度的升高反而逐渐降低.在一定温度范围内，酶的活性随着温度升高而升高，反应速度加快，当温度升高超出阈值时，酶蛋白变性失活，从而使酶的活力降低.

2.2 正交实验

2.2.1 蕨麻多糖复合酶最佳配比的正交实验结果及分析

通过对蕨麻多糖复合酶的配比进行正交试验，得出结果见表3.

表3 L9(33)正交试验结果及分析Table 3 Results and analysis of L9(33)orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

由表3可以看出，影响蕨麻多糖得率的复合酶因素中:复合酶的配比为A＞C＞B，即纤维素酶＞木瓜蛋白酶＞果胶酶，即在这三种酶中，对蕨麻多糖得率影响最大的是纤维素酶，分析原因可能是因为植物细胞的细胞壁主要成分是纤维素，通过对细胞壁的破坏从而更有利于多糖的溶解.通过正交试验极差分析得出的最佳酶配比为A3B2C1，但是从9个处理中直观的找出最优水平为9号处理，即A3B3C2，试验指标值为6.12.所以最佳酶配比为纤维素酶为2.0%，木瓜蛋白酶为1.0%，果胶酶为2.0%.

2.2.2 提取条件的正交实验结果

蕨麻多糖的正交实验是在单因素试验和复合酶配比的正交试验的基础上，选取四因素三水平进行正交试验，得到的结果见表4.

为确定复合酶的最佳配比，设计了复合酶最佳配比的正交试验，得到了三种复合酶的最佳配比，然后在此基础上对酶解的提取工艺进行优化.通过单因素试验，设计四个单因素且每个因素选取3个水平，进行正交试验，由表4可知，对蕨麻多糖得率影响由大到小依次为:料液比、温度、pH值和酶解时间，通过极差分析得出的最佳提取工艺条件为A3B2C2D1，即最佳料液比为1:30，pH值为4.5，温度为45℃，酶解时间为60min.

表4 L9(34)正交试验结果及分析Table 4 Results and analysis of L9(34)orthogonal test on polysaccharides extraction conditions

2.2.3 验证试验

在极差分析得到的最佳理论条件(即料液比1:30、pH4.5、酶解温度45℃、酶解时间60min)下进行三次平行试验，结果表明:最佳理论条件A3B2C2D1的多糖得率平均为8.12%，比正交试验结果A3B3C2D1的得率(8.03%)高，说明提取的最佳工艺为A3B2C2D1.

2.3 蕨麻多糖的抗氧化活性

图5 对超氧阴离子自由基的清除率的影响Fig.5 Effect of superoxide anion free radical scavenging

2.3.1 采用超氧阴离子自由基清除率的测定确定抗氧化性能由图5可以看出，在蕨麻多糖的质量浓度为0.1 -0.4mg/ml之间时，清除超氧阴离子自由基的能力随着浓度的增加而增加；而当质量浓度为0.5mg/ml时，清除率明显下降，因此，蕨麻多糖对超氧阴离子自由基有较好的清除能力即有一定的抗氧化性能.

图6 对羟自由基的清除作用的影响Fig.6 Effect of hydroxyl free radical scavenging

2.3.2 采用羟自由基清除率的测定确定抗氧化性能随着蕨麻多糖浓度的增大，对羟自由基的清除作用逐渐增强，说明蕨麻多糖具有良好的抗氧化性能，且由图可知，对羟自由基的清除能力与其浓度具有明显的量效关系，因此，对羟自由基有一定的清除作用即具有较好的抗氧化性能.

3 结论

使用复合酶法提取蕨麻多糖，在单因素实验的基础上，分别对复合酶配比和蕨麻多糖提取工艺进行正交实验优化多糖得率，我们得出:酶的最佳配比为纤维素酶2.0%，木瓜蛋白酶1.0%，果胶酶2.0%；复合酶法提取蕨麻多糖的优化工艺条件为:最佳料液比为1:30，最佳pH值为4.5，最佳温度为45℃，最佳酶解时间为60min，在这种条件下，蕨麻多糖得率为8.12%，与一般的水浸提法多糖得率的2.54%[25]相比，多糖含量近乎提高了3倍，说明使用复合酶法可大大提高蕨麻多糖的提取率.蕨麻多糖的体外抗氧化实验表明，蕨麻多糖具有抗氧化活性，且对不同自由基的清除能力不同，其中对羟自由基的清除能力要比超氧阴离子自由基强.

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(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑:周序林，郑玉才)

Extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme method

CHEN Lian-hong1，ZHANG Meng-yuan1，WU Hong1，SUN Qing2，LI Jian3
(1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.School of Foreign Languages，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；
3.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

The extraction and antioxidant activities of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme(cellulase，Pectinase，papain)method were studied.Single factor experiments were conduced to examine the ratio of the solid-liquid，pH value，temperature by enzymatic hydrolysis，extracting time，which provided optimum reaction conditions for extraction of polysaccharides in Potentilla anserina.The best ratio of combined enzymes and the effects of extraction temperature，extraction time，pH value，the ratio of solid-liquid on yield rate of polysaccharides were determined through orthogonal test and its antioxidant activities were tested by·OH and O2-·radical scavenging experiments.The best ratio of combined enzymes was cellulase of 2.0%，papain of 1.0%，and pectinase of 2.0%.The optimum reaction condition was temperature of 45℃，pH value of 4.5，time of 60 min，the solid-liquid ratio of 1:30，the extraction rate reached 8.12%.This study developed the best extraction process of polysaccharides from Potentilla anserina with combined-enzyme method.The result shows that polysaccharides has good scavenging effect on·OH and O2-·，and the scavenging effect of·OH is better than that of O2-·.

complex enzyme；Potentilla anserina；polysaccharide；antioxidantion

10.11920/xnmdzk.2015.04.003

2015-05-21

陈炼红(1967-)，女，藏族，成都人，副教授，研究方向为民族食品资源开发与研究；E-mail:lianhong_chen＠163.com

李键(1967-)，男，教授，研究方向为民族食品资源开发与研究；E-mail:lijiangracy＠yahoo.com

公益性行业(农业)科研专项项目(201203009)