流式细胞术在营养和食品卫生评价中的研究进展

李文华，胡茂志 ，严秋香，魏文娴，崔桂友

（1.扬州大学测试中心，江苏扬州225009;2.扬州大学旅游烹饪学院，江苏扬州225009;3.扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室，江苏扬州 225009）

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是20世纪60年代末发展起来的一项细胞分析技术，它集激光技术、光电测量技术、生物技术、计算机技术、流体力学以及荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分选纯度高、方法灵活等特点。流式细胞仪(flow cytometer)是应用FCM的有效工具，经过多年的不断发展和改进，现已广泛应用于各种基础研究和临床检测［1］。在食品科学领域，随着食品安全要求的提高，特别是在食品生产和加工过程中的质量控制以及食品功能成分评价等方面，FCM已成为一种重要的分析技术，呈现出较好的应用前景。笔者就其在营养与食品卫生评价方面的应用研究进展作一综述。

1 流式细胞仪概述

流式细胞仪主要有4部分组成:流动室和液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统。具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统。将待测细胞制成单细胞悬液，荧光标记后，在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流动室的检测区域。用激光垂直照射检测区的细胞流，被荧光标记的细胞产生散射光和荧光，同时被前向光电二极管和侧向90°方向的光电倍增管接收。前向散射光信号反映了细胞体积的相对大小，侧向散射光信号反映了细胞内颗粒性物质的复杂程度。荧光信号代表了所标记的细胞表面或内部的分子信息，这些光信号被转换成电信号，经A/D转换器传输到微机处理器形成数据文件。细胞分选是将待测液滴充以电荷，让其在高压电场的作用下偏转，落入不同的收集管中，从而实现细胞的分离［2］。在食品科学领域，FCM是单细胞水平分析的有力工具。目前，已涉及多种参数的检测，包括细胞活性、核酸含量、细胞凋亡、酶活性、膜电位、细胞内pH测定等。

2 FCM在食品功能成分活性评价中的应用

食品功能成分对人体细胞作用机制的分析，为评价食品功能和开发新的功能性食品提供了依据，而FCM在其中发挥了重要作用。

2.1 增强免疫方面的评价 保健营养品酪蛋白糖巨肽(caseino-glycomacropeptide，CGMP)是κ-酪蛋白经凝乳酶和胃蛋白酶酶解后形成的含有64个氨基酸的不同种类肽段，具有多种生物学活性和独特的营养特性，叶雷等用FCM研究了CGMP对小鼠腹腔免疫细胞及肠黏膜屏障的影响，发现CGMP可以增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，诱导肠道黏膜免疫应答，增强肠黏膜免疫屏障功能，有望开发为抑制肠道炎症的功能性食品添加剂。另外，他们还研究了CGMP对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响，发现乳源CGMP能够引起小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化，调节机体T淋巴细胞亚群的平衡。这说明，CGMP可作为功能性食品对外周血T淋巴细胞亚群的失衡有缓解作用［3-4］。

n-3多不饱和脂肪酸食物主要包括α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。试验和临床研究表明，n-3多不饱和脂肪酸可以用于治疗自身免疫和过敏性炎症。Mukaro等运用FCM分析研究发现，长期食用富含n-3的食品，会降低NK细胞和中性粒细胞的碘化活性(iodination activity)，提高淋巴细胞产生淋巴毒素的水平，从而降低炎性反应和组织损伤［5］。

2.2 抗氧化方面的评价 大豆异黄酮(Soy isoflavone，SI)是主要存在于豆科植物中的一类植物雌激素。近年来，大量的研究表明，SI的抗氧化效应介导了其广泛的生物学效应，包括防治心血管疾病、更年期综合症、骨质疏松、乳腺癌和前列腺癌等疾病，是一类优良的天然抗氧化剂。染料木素(Genistein)，又称染料木黄酮、金雀异黄酮，是大豆异黄酮的一种。张婷用FCM研究证实，染料木素对氧化应激诱导的人脐带静脉内皮细胞活力下降和凋亡有保护作用，染料木素可浓度依赖的上调超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和GSH-Px的水平，并抑制氧化应激诱导的SOD、CAT和GSH-Px水平的降低，表明其对内源性抗氧化剂的上调是其抗氧化作用的重要机制之一［6］。

红细胞膜病变是严重的糖尿病并发症。研究表明，n-3脂肪酸能降低脂质过氧化作用，提高红细胞膜中α-或γ-维生素E含量。Yang等利用FCM分析了红细胞磷脂对称性和膜脂肪酸的组成表明，富含n-3脂肪酸的麻子油可提高红细胞的抗氧化能力，抑制高糖饮食引起的红细胞脂质过氧化反应和膜变形［7］。

香菇多糖(Lentinan)是从香菇子实体中分离出的天然活性成分，因具有良好的抗肿瘤、抗病毒、调节机体免疫力和刺激干扰素形成等功效逐渐引起了人们的关注。Wang等用FCM分析了不同浓度香菇多糖喂养海参后的变化，发现一定浓度的香菇多糖刺激后会引起海参体腔细胞活力升高和吞噬作用明显增强，同时也增加了体腔细胞内的CAT和碱性磷酸酶的活力［8］。

2.3 抗肿瘤方面的评价 人类饮食中广泛存在黄酮类化合物，Chang等利用FCM等分析了23种黄酮对乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)、结肠直肠癌细胞(LoVo和DLD-1)和前列腺癌细胞(PC3)的毒性发现，它们诱导细胞凋亡的能力存在差异，其中，3，6-二羟基黄酮(3，6-dihydroxylflavone)最强，并推测其可以作为癌症的化疗药物来开发［9］。

海带多糖(Laminaria polysaccharide)是从海带中提取的含有多种单糖和硫酸基的水溶性杂多糖，研究表明，海带多糖具有抗肿瘤的效果。Ji等通过FCM分析了海带多糖诱导人LoVo细胞凋亡的机制，发现海带多糖通过增强机体的免疫功能而间接抑制或杀死肿瘤细胞。它不仅能激活巨噬细胞和T细胞等免疫细胞，还能促进白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子的生成，从多个方面抑制肿瘤细胞的生长扩散［10］。

白藜芦醇(resveratrol)是一种由植物产生的多酚类物质，主要存在于红葡萄皮、豌豆、坚果、蓝莓、桑椹、蔓越莓、姜黄和菠菜等植物组织中。阿萨通过FCM分析细胞中GSHPx等抗氧化酶的活性发现，白藜芦醇可通过调节GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶来达到抗肿瘤的效果［11］。

2.4 其他方面的评价 肠促胰素是人体内一种肠源性激素，在进食后，该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。肠促胰素主要是由GLP-1(glucagon-like peptide-1)和 GIP(glucose-dependent insulinotropic peptide)组成，其中GLP-1对2型糖尿病的发生发展具有较大影响。Gonzalez-Abuin等通过FCM分析了葡萄籽原花青素提取物对肠道内分泌细胞(STC-1)的影响，发现一定浓度的葡萄籽原花青素提取物可通过促进STC-1细胞分泌GLP-1来调节体内葡萄糖平衡［12］。

高脂肪饮食会引起内皮细胞功能障碍，从而可能会导致动脉粥样硬化，而循环微粒子(circulating microparticles，MPs)和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells)在高脂肪饮食后对内皮细胞影响较大。Bulut等通过FCM分析了成人在高脂肪饮食后饮用矿泉水、可乐、红酒以及白酒的影响，发现饮用可乐组MPs大量增加(增加了62%)，而红酒组MPs增加量最小(增加5%)，因此认为，高脂肪饮食后饮用少量红酒可减少对机体的危害［13］。

食物过敏可引起皮肤、消化、呼吸和神经系统等多个系统的过敏症状并造成损害。中药复方Formula-2(FAHF-2)由灵芝、干姜、黄柏、桂枝、川椒、乌梅、人参、当归和黄连9种中药组成，被证明是安全有效的治疗食物过敏的中药。Patil等用FCM分析了FAHF-2的作用机理，发现其可有效缓解食物过敏引起的嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞升高［14］。

此外，FCM还可应用于临床上儿童对牛奶的免疫耐受评价、食品添加剂的细胞毒性评价、黄酮类化合物的药理潜能评价等，为保健食品和医药品的分析提供了科学依据。

3 FCM在食品微生物检测方面的应用

FCM发展于20世纪60年代，并迅速用于医学领域分析哺乳动物细胞，在20世纪70年代后期开始用于微生物领域，但因微生物细胞体积比哺乳动物细胞小，限制了微生物检测方面的应用。1990年，FCM首次应用于酒类酿造。之后，被广泛运用于面包发酵、酿酒等行业，并逐渐用于其他食品和饮料行业［15］。目前，在食品工业中，FCM已经成为微生物检测的常用工具。

3.1 细菌活性判断方面的应用 结合细菌活性染料，FCM可以实现对活菌的检测。通过荧光信号的强弱或有无可知菌体活性的大小或有无，并且该方法可以检测低活性的细胞，而如果使用传统的培养法或亚甲基蓝染色法检测低活性细胞，则误差较大。Schenk等分析紫外线照射对大肠杆菌ATCC11229、无害李斯特菌ATCC33090和酿酒酵母KE162的损伤发现，随着紫外曝光的时间不同，细胞损伤程度也不同。短时间内，大肠杆菌和酿酒酵母的PI阳性率增加，而无害李斯特菌由于膜破裂而全部被杀死［16］。叶雷等利用荧光染料标记直投式发酵剂菌体细胞，分析了细菌的活力以及生存状态［17］，这对科学评价各种微生物发酵剂的品质具有现实意义。

3.2 食品微生物的在线监测 食品的生产一般是一个连续的流水线过程，最终产品是否合格依赖于各环节的质量保证，这就是实时监测的意义所在。Broger等设计出一种低通量FCM检测系统(Flow injection flow cytometry)，用于实时、在线监测生物反应器中菌体生长的变化过程。通过与其他荧光检测方法比较发现，只有FCM可以从大量弱荧光信号的菌体中辨别出少量荧光信号强的菌体。并且发现，在菌体培养过程中，个体之间的异质性明显。因为菌群中菌体信号分散在一个较宽的范围内，因此设想，可以从中选择高产量、稳定的菌株［15，18］。由以上可知，该技术在产品实时监测方面具有传统方法无法比拟的特点。

3.3 益生菌方面的应用 益生菌(probiotics)是指一类自然存在的有益宿主的微生物。它们可促进机体肠道微生态平衡、增强机体免疫功能，最终达到提高抗病力和促生长等益生作用。Geng等用FCM分析了4种商业乳制品中活的双歧杆菌含量，检测结果与传统培养检测方法相一致，但相较于传统方法需72 h，FCM检测方法仅在2 h内即可得到检测结果，大大缩减了检测时间［19］。Chen等用FCM方法检测了乳酸菌DPC16对不同压力的抵抗力，发现DPC16具有较强的耐酸性;另外，相较于其他糖类，乳糖可较好地保持冻干法处理后的 DPC16 的活性［20］。

3.4 食源性致病菌的检测 食品生产、运输、消费过程中的微生物污染造成的食源性疾病是食品安全中最突出的问题，尽管近年来人们不断加强卫生监管，致病菌污染食品的案例仍屡屡发生。FCM与免疫荧光抗体标记技术相结合，通过检测病原菌表面的特征性抗原，而特异性检测食源性致病菌。目前，该技术已成功地应用于沙门菌(Salmonella)、大肠杆菌、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)等病原菌的检测。并且，将染料之间的荧光能量共振转移效应与免疫荧光方法相结合，可以在一定程度上减小抗体的非特异性吸附，从而提高检测灵敏度［21］。

4 小结与展望

在食品和饮料行业，进行传统常规检测会大大延误产品上市时间，而流式细胞术与传统检测技术相比，具有检测速度快、收集数据量大、分析全面、方法灵活、重复性好等优点，目前已成为食品生产和加工过程中质量检测的一种较好的方法。虽然流式细胞术应用于食品行业具有诸多优点，但该方法的推广还是存在一些问题，如流式细胞仪价格昂贵，检测用微球和荧光染料成本较高，样品前处理复杂等。针对这些问题，期望在今后流式细胞仪的发展过程中，可以研制出价格低廉的试剂，优化样品前处理技术，同时使检测设备更便捷、易操作。相信在不久的将来，流式细胞术会更广泛地应用于食品行业。

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