大鼠动脉粥样硬化病变各阶段内皮依赖性舒张功能以及亲环素A表达的变化

盛冲霄，黎红华，刘康，冯海松

大鼠动脉粥样硬化病变各阶段内皮依赖性舒张功能以及亲环素A表达的变化

盛冲霄，黎红华，刘康，冯海松

目的：观察高脂饮食喂养大鼠动脉粥样硬化病变各阶段内皮依赖性舒张功能的改变以及亲环素A（CyPA）的表达变化。

方法：雄性Wistar大鼠30只随机分为4组，对照组（6只），动脉粥样硬化8周组（AS 8W组）8只，动脉粥样硬化12周组（AS 12W组）8只，动脉粥样硬化15周组（AS 15W组）8只。给予动脉粥样硬化组高脂饲料喂养，并给予维生素D3注射液60万IU/kg一次性腹腔注射，对照组给予基础饲料喂养。同期处死大鼠，分离腹主动脉，行苏木素伊红（HE）染色，免疫组化法检测动脉壁CyPA的表达。另外截取约5 mm新鲜大鼠腹主动脉环，在离体器官浴槽中观察离体腹主动脉环对乙酰胆碱舒张反应。

结果：随着造模时间的进展，各组大鼠分别呈现出了血管正常结构、内皮细胞破坏，平滑肌细胞增生、粥样斑块形成以及钙化斑块形成等不同的病变特征。内皮依赖性舒张功能进行性下降，对照组、AS 8W组、AS 12W组、AS 15W组最大舒张度分别为（93.46±2.80）%、（82.58±3.25）%、（61.19±3.72）%、（41.28±2.68）%，各组间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。血管内皮细胞以及平滑肌细胞CyPA的表达不断增加，四组大鼠CyPA平均光密度测定分别为0.25±0.06、 0.34±0.09、0.53±0.09、0.68±0.13，各组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

结论： CyPA的表达随着病变进展不断增加，内皮依赖血管舒张功能进行性下降。CyPA的表达与动脉粥样硬化病变严重程度有关。CyPA可能是动脉粥样硬化的始动因素之一。

动脉粥样硬化；亲环素A ；内皮依赖性舒张功能

Methods: A total of 30 male Wistar rats were divided into 4 groups: Control group, the rats received normal diet, and 3 atherosclerosis groups, the rats received high cholesterol diet for different period of time and a single dose intraperitoneal injection of Vitamin D3 at 600,000 IU/kg, as Atherosclerosis at 8 weeks (AS 8W) group, AS 12W group and AS 15W group, n=8 in each AS group. The rats were sacrificed at the same time to isolate aorta abdominalis. The expression of CyPA at the wall of aorta abdominalis was detected by HE staining and immunohistochemistry. In addition, the aorta abdominalises was cut into 5 mm rings to observe its response to acethylcholine in exvivo organ bath.

Results: With prolonged modeling time, the rats at different groups presented normal vessel structure, endothelial cell damage, vessel smooth muscle cell proliferation, atherosclerosis plaque formation and calcified plaque formation for different

pathological characteristics. The endothelial-dependent vasodilatation was decreased and the maximum vasodilatation percentage in Control group, AS 8W group, AS 12W group and AS 15W group were at (93.46 ± 2.80) %, (82.58 ± 3.25) %, (61.19 ± 3.72)% and (41.28 ± 2.68)% respectively, P＜0.05 between each group. The CyPA expression in endothelial cell and vessel smooth muscle cell were increased accordingly in 4 groups by OD value as (0.25 ± 0.06), (0.34 ± 0.09), (0.53 ± 0.09) and (0.68 ± 0.13) respectively, P＜0.05 between each group.

Conclusion: The CyPA expression increased and the endothelial-dependent vasodilatation decreased with the progress of atherosclerosis accordingly in experimental rats. The expression level of CyPA is related to atherosclerosis degree and it is one of the initial factors for atherosclerosis in rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:576.)

动脉粥样硬化以内皮功能障碍为起始事件，氧化应激、炎症反应等贯穿了动脉粥样硬化的发病过程[1，2]。近年来，亲环素A（cyclophilin A，CyPA）与氧化应激、动脉粥样硬化的关系引起了广泛关注。CyPA被认为是重要的氧化应激诱导因子，可在氧化应激刺激下由内皮细胞、血管平滑肌细胞分泌[3]。CyPA刺激血管平滑肌细胞增殖以及炎症细胞迁移，引起内皮细胞凋亡，导致内皮功能障碍，参与动脉粥样硬化的发病过程[4]。有研究探讨了血清CyPA浓度与急性冠状动脉综合征的关系，发现急性冠状动脉综合征患者血清CyPA浓度明显高于稳定性心绞痛和正常对照者血清水平[5]。但是CyPA在动脉粥样硬化病理过程中各阶段的表达变化以及伴随的内皮依赖性舒张功能的变化目前尚少见报道。本研究旨在揭示大鼠动脉粥样硬化病理过程中CyPA在动脉壁内皮细胞以及血管平滑肌细胞表达含量的变化，以及相应的内皮依赖性血管舒张功能的变化，为动脉粥样硬化的预防和治疗提供新的参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物：实验时间为2014-03至2014-07。无特定病原体（SPF）级健康雄性Wistar大鼠30只，体重180～200 g，湖北省实验动物研究中心提供，分笼饲养在武汉大学动物实验中心SPF环境中，室内温度（22±1）℃,湿度（60±10）%,自由进食水，12 h明暗交替。

主要实验药剂：维生素D3注射液（上海通用药业），胆固醇、胆酸钠（武汉凯润成生物工程有限公司），兔抗CyPA抗体（北京索莱宝科技有限公司），免疫组化SP试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。基础饲料由武汉大学动物实验中心提供，高脂饲料（81.3%普通饲料、5%蔗糖、10%猪油、3%胆固醇、0.5% 胆酸盐、0.2%丙基硫氧嘧啶）由湖北万千佳兴生物科技有限公司加工。

主要仪器：BL-420S 生物机能实验系统、HV-4离体组织器官恒温灌流系统、JH-2型张力换能器，由成都泰盟公司生产。YB-6型生物组织包埋机（上海华岩仪器有限公司），RM2016型Leica石蜡切片机（德国leica公司），OLYMPUS BX51照相显微镜（日本Olympus公司）等。

1.2 方法

所有大鼠经3天适应性喂养后随机分为4组，对照组6只以及动脉粥样硬化8周组（AS 8W组）8只，动脉粥样硬化12周组（AS 12W组）8只，动脉粥样硬化15周组（AS 15W组）8只。各组大鼠造模时间不同，以保证同期处死采集标本。造模方法参考文献[6]。各动脉粥样硬化组给予高脂饲料喂养，并在分组后第2天给予一次性腹腔注射维生素D3注射液60万IU/kg。对照组给予普通基础饲料喂养，腹腔注射等量生理盐水。

1.3 取材

同期对各组大鼠进行取材。过量水合氯醛麻醉处死大鼠，快速分离腹主动脉，剔除周围组织。

离体血管环内皮依赖性舒张功能测定：每条腹主动脉截取约5 mm长血管环连接到JH-2型张力换能器，置于含Krebs液的HV-4离体恒温组织器官灌流系统，给予2 g张力负荷，通入95%O2和5%CO2的混合气体，在37℃水浴中平衡1 h。以10-6mol/L去甲肾上腺素预刺激血管环，张力达平衡后加入不同浓度的乙酰胆碱（10-9～10-4mol/L）, 记录每一浓度下血管环的张力，绘制浓度反应曲线。

苏木素伊红（HE）染色：新鲜腹主动脉以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蜡包埋，切片（横切，片厚2 μm），按照HE染色步骤染色，置于400倍光镜下观察并摄片。

免疫组织化学SP法染色与数据采集： 石蜡切片按照免疫组化SP法步骤进行染色。以胞浆胞膜出现棕黄色染色为CyPA染色阳性。每张切片随机抽取3个不同的400倍视野。采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化结果进行分析，测定其平均光密度（平均光密度=累积光密度/测量区域面积）。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 离体动脉环内皮依赖性舒张功能测定

在器官浴槽中加入不同浓度（ 10-9～10-4mol/L）的乙酰胆碱后各组大鼠动脉环均出现内皮依赖性血管舒张反应。如表1所示，对照组动脉环内皮依赖性舒张功能良好，最大舒张度达（93.46±2.80）%。而AS 8W组、AS 12W组、AS 15W组最大舒张度都有不同程度下降，AS 15W组下降程度最为明显，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。另外，在加入乙酰胆碱10-9mol/L 、10-8mol/L 、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L浓度后，各组之间舒张度比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

表1 不同浓度乙酰胆碱下不同组别大鼠动脉环的内皮依赖性舒张度的比较

表1 不同浓度乙酰胆碱下不同组别大鼠动脉环的内皮依赖性舒张度的比较

注： AS：动脉粥样硬化

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2.2 大鼠腹主动脉HE染色结果

光镜下，对照组腹主动脉内膜完整光滑，内皮细胞排列整齐，无增生；平滑肌细胞排列规则，无增生；弹性纤维连续无中断（图1A）。AS 8W组可见内皮细胞增生，凋亡，内膜失去连续性；平滑肌细胞增生，排列紊乱（图1B）。AS 12W组可见明显粥样斑块形成，内膜局部区域可见明显炎性细胞以及泡沫细胞浸润，细胞外基质明显增多，多处内膜脱落（图1C）。AS 15W组可见内膜断裂，中层钙化斑块形成，弹性层失去连续性，可见少量泡沫细胞形成（图1D）。

2.3 大鼠腹主动脉CyPA免疫组化检测结果

光镜下观察各组大鼠腹主动脉CyPA免疫组化染色，可见各组大鼠腹主动脉内皮细胞和平滑肌细胞胞浆均有CyPA表达（图2A～2D）。各组平均光密度结果： AS 15W组大鼠钙化斑块内部CyPA表达较对照组升高最为显著（0.68 ± 0.13 vs 0.25 ± 0.06, P＜0.05），AS 8W组以及AS 12W较对照组CyPA表达明显升高（0.34±0.09，0.53± 0.09 vs 0.25±0.06, P＜0.05），各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1 大鼠腹主动脉切片HE染色（×400）

图2 大鼠腹主动脉亲环素A免疫组化（×400）

3 讨论

CyPA属于亲环素家族，被认为是强效的免疫抑制剂环孢素A（cyclosporin A,CsA）的胞内受体。CyPA具有肽酰脯氨酰顺反异构酶活性，在蛋白质折叠、运输、细胞内信号传导等方面起了重要作用。氧化应激，由于体内过多的活性氧物质（ROS）而产生，促进了心血管疾病的发生[7]。Satoh等[8]证实，CyPA可以在氧化应激刺激下由血管平滑肌细胞分泌至胞外。分泌的CyPA通过刺激VSMC增殖以及炎症细胞迁移，促进内皮细胞凋亡以及表达白细胞黏附分子，刺激白细胞迁移，增强巨噬细胞的增殖扩散，以及增强血管平滑肌细胞的促炎信号转导等途径促进炎症反应以及动脉粥样硬化[9]。另外，体外研究也证实了CyPA导致内皮细胞功能障碍的能力[10]。

本研究使用高脂饲料喂养配合维生素D3注射大鼠建立动脉粥样硬化模型。高脂饮食可刺激大鼠体内氧化应激水平的升高[11]，相伴随的是CyPA分泌的增多，而分泌的细胞外CyPA刺激血管平滑肌细胞中细胞外信号调节激酶1/2（extrallular signal regul.ated protein kinase1/2，ERK1/2）, 蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（protein-serine-threoninekinase,Akt）和酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）等信号通路,进一步参与了ROS产物的生成，两者形成恶性循环[8]。

既往的研究观察到了动脉粥样斑块部位高表达的CyPA，但对于动脉粥样硬化疾病发生发展过程中动脉壁CyPA表达的变化鲜有报道。本研究动态观察大鼠动脉粥样硬化发展过程中各个阶段，通过比较正常、内皮改变、动脉粥样斑块形成、钙化等不同时期的大鼠腹主动脉CyPA表达量的差异，明确了CyPA在动脉粥样硬化疾病发展过程中的表达变化，证实了CyPA与动脉粥样硬化疾病严重程度的关系。我们发现随着造模时间的进展，大鼠腹主动脉正常的结构逐步破坏，至第8周可见内皮细胞凋亡，内皮依赖性舒张功能较正常组下降，这一发现与国外众多相关研究[12,13]所提出的“内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化的早期事件”结论一致。在这一时期，我们观察到血管壁CyPA的表达较正常组已有升高。所以，我们认为CyPA可能是动脉粥样硬化的始动因素之一。12周后，随着CyPA表达水平的进一步升高，刺激炎症细胞迁移，加剧炎症反应，血管结构上可见动脉粥样斑块形成，斑块部位可见炎性细胞浸润，泡沫细胞形成，内皮依赖性舒张功能相对第8周时明显下降。随着炎症进展，多种炎症介质诱导了血管壁成骨细胞的表达和活化，导致钙质沉积[14]。所以，至15周我们观察到了钙化斑块的形成，而CyPA的表达较前一阶段有明显升高。

综上所述，我们认为，高脂饮食诱导了大鼠体内氧化应激水平的升高，刺激血管平滑肌细胞分泌CyPA。而分泌至胞外的CyPA进一步加剧氧化应激，诱导炎症反应，促进泡沫细胞形成，逐步导致内皮损伤、粥样斑块形成、钙化斑块形成。我们认为CyPA可能是动脉粥样硬化的始动因素之一,CyPA促进了动脉粥样硬化的发生发展。CyPA与动脉粥样硬化病变的严重程度有关，其表达含量随着病变的进展而随之升高，CyPA可以成为动脉粥样硬化预防和治疗的新靶点。

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The Changes of Endothelial-dependent Vasodilatation and Cyclophilin A Expression at Different Phases of Atherosclerosis in Experimental Rats

SHENG Chong-xiao, LI Hong-hua, LIU Kang, FENG Hai-song.
Department of Neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan (430070), Hubei, China

Objective: To observe the changes of endothelial-dependent vasodilatation and cyclophilin A (CyPA) expression at different phases of atherosclerosis in experimental rats.

Atherosclerosis; Cyclophilin A; Endothelial-dependent vasodilatation

2014-09-16）

（编辑：漆利萍）

湖北省自然科学基金（2013CFB428）

430070 湖北省武汉市，中国人民解放军广州军区武汉总医院 神经内科

盛冲霄 硕士研究生 主要从事氧化应激与动脉硬化研究 Email：474953755@qq.com

黎红华

Email：Lihonghua567@aliyun.com

R541

A

1000-3614（2015）06-0576-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.06.017