亳菊花中β-葡萄糖苷酶的提取和酶学性质研究

亳菊花中β-葡萄糖苷酶的提取和酶学性质研究

左亚锋1，张伟1,2,3，吴德玲2,3，俞年军1,2，金传山1,2，刘劲松1,2,3，朱月健4，闫攀1

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；2.安徽省现代中药重点实验室，安徽 合肥230012；

3.安徽省中医药科学院药物化学研究所，安徽 合肥230012；4.安徽济人药业有限公司，安徽 亳州236000)

[摘要]目的测定亳菊花中β-葡萄糖苷酶的活性，研究亳菊花中β-葡萄糖苷酶的基本酶学性质。方法采用对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)法考察亳菊花中β-葡萄糖苷酶活性测定的最佳条件及其酶学性质。结果当0.2 mL酶液、20 mmol/L pNPG 0.2 mL、0.6 mL pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液在温度为50 ℃的水浴中反应45 min时，酶活性最高。在此条件下对亳菊花的粗酶液中β-葡萄糖苷酶的基本酶学性质进行初步研究，结果表明该酶在30～50 ℃时，随着温度升高，酶活力有上升趋势，其热稳定性较好；pH值在3.2～5.4之间时，相对酶活性均在80%以上；酶在4 ℃下的保存稳定性较好。结论本研究所测定的亳菊花中β-葡萄糖苷酶活性的最佳条件及酶学性质可为亳菊花炮制原理研究奠定基础。

[关键词]亳菊花；对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷法；β-葡萄糖苷酶活性

[中图分类号]R284.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.024

基金项目：国家自然科学基金青年项目(81303229)；安徽省自然科学

作者简介：左亚锋(1990-)，男，硕士研究生

收稿日期：(2015-05-06；编辑：张倩)

亳菊是临床上常用的一味中药，其性平，味甘，微苦，归肺、肝经，具有平肝明目、疏风清热的功效[1]。现代研究认为，“疏风”类中药具有扩张血管，促进血液循环，降低血压的作用，这一药理作用与亳菊中黄酮类化合物药理作用基本一致。植物中黄酮类化合物的合成、分解与温度和植物体中酶密切相关[2-5]。本课题组前期研究[6]发现，经过烘干加工的亳菊中黄酮苷类成分较阴干样品含量降低，而苷元含量则相对升高，初步推测其原因可能是加热激活了亳菊中β-葡萄糖苷酶活性，由酶作用于亳菊中黄酮苷类成分，引起黄酮苷类化合物的分解。而亳菊在不同的加工炮制过程中，外在因素的改变就会对酶活性产生影响，从而使黄酮类化合物产生变化。因此，酶是影响亳菊质量的一个重要因素。

通信作者：吴德玲，dlwu7375@sina.com

A Preliminary Study of Specification and Grade of Cortex Moutan

ZHANGYu-feng1,WANGJun2,3,FANGCheng-wu1,2,3,LIJing3,4,WUJi-hua4,5

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China;2.SchoolofPharmacy,BozhouVocationalandTechnicalCollege,AnhuiBozhou236800,China;3.BozhouInstituteofChineseMedicine,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiBozhou236800,China; 4.BozhouInstituteforFoodandDrugControl,AnhuiBozhou236800,China;5.BeijingTongrentangTraditionalChineseMedicinalMaterialsCo.,Ltd.inAnhui,AnhuiTongling244000,China)

Abstract[] ObjectiveTo explore the correlation of the accumulation of the main active ingredients in Cortex Moutan with the thickness and tissue structure of root, and to provide a scientific basis for quality evaluation of Cortex Moutan and its specification and grade classification. MethodsThe root system of five-year-old Paeonia ostii was collected, and the roots in the root system were classified according to thickness, length, and position. Commercially available Cortex Moutan with different specifications was collected from the market. The content of paeoniflorin and paeonal in each sample was determined using high-performance liquid chromatography. ResultsAmong Cortex Moutan of different grades, grade 4 Cortex Moutan had the highest content of paeoniflorin, while grade 1 Cortex Moutan had the highest content of paeonal. The content of paeoniflorin was lowest in the main root and highest in lateral roots. In the market, the unscraped Cortex Moutan had higher content of paeoniflorin but lower content of paeonal than the scraped Cortex Moutan. ConclusionThe thin Cortex Moutan has a relatively high content of paeoniflorin, suggesting that more paeoniflorin accumulates in the periderm. Due to the opposite trends in accumulation of paeoniflorin and paeonal, the quality standard of Cortex Moutan needs further studies.

[Key words] Cortex Moutan; root system ofPaeoniaostii; specification and grade; paeoniflorin; paeonal

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)属于水解酶类，其能够催化各类β-D-葡萄糖苷、二糖以及寡聚糖糖苷键的水解释放葡萄糖和相应的配基。自1837年Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现该酶，其后研究中该酶被发现存在于自然界的许多植物中。植物来源的β-葡萄糖苷酶具有许多重要的生物学功能，董尚胜等[7-8]、赵芹等[9]对来源于茶叶、栀子花、茉莉花的β-葡萄糖苷酶进行研究时发现，β-葡萄糖苷酶在醇系香气的形成中起到重要作用。但是由于不同来源的β-葡萄糖苷酶其酶学性质也存在很大差异[10-11]，因此本课题组对新鲜亳菊中β-葡萄糖苷酶的酶活性进行测定，并且对β-葡萄糖苷酶的酶学特性进行相关研究，为研究其在亳菊花炮制加工中的作用及其对亳菊花品质的影响奠定基础。

1　材料

1.1仪器UV-759CRT紫外可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；AB135-S型十万分之一电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；AS-3120型超声波清洗器：天津奥特赛恩斯公司；HH-S恒温水浴锅：江苏国胜实验仪器厂；Heraeus Multifuge X1R离心机：美国赛默飞公司；SHB-Ⅲ水循环式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；MJ-BL25B31搅拌机：广东美的精品电器制造有限公司。

1.2试剂亳菊采自亳州药材基地，由安徽中医药大学生药学系刘守金教授鉴定为菊科植物亳菊Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. ‘Boju’ cv. nov.的花；对硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG)：美国Sigma公司；对硝基苯酚、聚乙烯吡咯烷酮K-30(polyvinylpyrrolidone，PVP)、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠：国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；水为蒸馏水。

2　方法与结果

2.1β-葡萄糖苷酶粗酶提取液的制备称取新鲜亳菊10.0 g，置于榨汁机中，加入少量石英沙，称量与亳菊等量的PVP[11]，用适量预冷的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH值为4.0)溶解后加入榨汁机中，榨汁1 min成匀浆后于低温下缓慢搅拌30 min后抽滤。抽滤液置于低温冷冻离心机中12 000 r/min离心20 min，取上清液作为粗酶液，4 ℃下保存备用。

2.2β-葡萄糖苷酶活性测定[12-13]

2.2.1β-葡萄糖苷酶活性定义以pNPG为底物，在pH值为4.0，温度为50 ℃的分析条件下，每分钟释放出1 μmol对硝基苯酚所需要的酶量。

2.2.2对硝基苯酚标准曲线的绘制对硝基苯酚含量用分光光度法测定。精密称量139.1 mg对硝基苯酚，用1 mol/L Na2CO3溶液作为溶剂，配成浓度分别为0.001、0.005、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06 μmol/mL的对硝基苯酚标准溶液。以蒸馏水为空白，在400 nm波长处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，绘制标准曲线。得出对硝基苯酚标准曲线的回归方程为y=21.049x，r=0.999 5。

在试管中加入0.2 mL pNPG，0.6 mL柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH值为4.0)和0.2 mL粗酶液，在50 ℃水浴条件下反应45 min。反应结束后，向反应体系中加入2.5 mL浓度为1 mol/L的Na2CO3终止反应，在400 nm波长下测定其吸光度值。根据标准曲线回归方程，计算出对硝基苯酚含量，然后换算得出酶活力。

2.3影响β-葡萄糖苷酶提取与活性因素考察

2.3.1β-葡萄糖苷酶提取液的类型及pH值对酶活性的影响酶是具有生物催化活性的生物大分子，稳定性较差，酶的活性中心必须在特定的环境中才最容易与底物结合或具有最大的催化活性。本实验用柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH值分别为3.4、3.8、4.0、4.4、4.8、5.0、5.4)，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH值分别为3.4、3.8、4.0、4.4、4.8、5.0、5.4)，按“2.2”项下方法提取，并按“2.3”项下方法用相应的缓冲液进行酶活性测定，测定不同类型的缓冲液及其pH值对酶活性的影响。结果表明，当提取液为pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液时效果最好，酶活力达到最大。见图1。

2.3.2底物浓度对酶活性的影响随着底物浓度的升高，酶活性中心与底物结合的量越多，反应速度增大，酶活性逐渐增大。但是当底物浓度过高时反而会对酶有抑制作用。这是因为酶活性中心结合过量的底物后，酶活性中心的基团就不能针对一个底物进行催化水解。本实验按照“2.3”项下方法，其他条件不变，仅改变反应体系pNPG浓度(分别为5、10、15、20、25、30 mmol/L)，以测定反应体系中pNPG浓度对酶活性的影响。结果表明，当pNPG浓度达到20 mmol/L时，酶活性达到最大值。见图2。

2.3.3反应温度对酶活性的影响温度对酶活性影响较大。低温时酶活性较低，随着温度升高，酶活性增大，但温度过高又可能使酶变性。在一定条件下，酶活性达到最高时该温度就是酶的最适温度。本实验按照“2.3”项下方法，其他条件不变，仅改变反应体系温度(分别为30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃)以测定反应体系不同温度对酶活性的影响。结果表明，最适温度为50 ℃。见图3。

2.3.4反应时间对酶活性的影响酶活性是通过测定一定时间内产物变化量而求得的，因此精确的计时很重要。按照“2.3”项下方法，其他条件不变，仅改变反应体系时间(分别为15、30、45、60、75、90、105、120 min)以测定反应体系的时间对酶活性的影响。结果表明，最佳反应时间是45 min。见图4。

3　亳菊花中β-葡萄糖苷酶的基本酶学性质

3.1酶的热稳定性将粗酶液加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，观察其在不同温度下(30～50 ℃)的水浴中反应，定时取样。按照“2.3”项下方法测定酶剩余活性变化，绘制热稳定性曲线。结果表明，该酶保存稳定性较好。见图5。

3.2酶的pH值稳定性将粗酶液加入不同pH值柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，在4 ℃下静置24 h。按照“2.3”项下方法测定剩余酶活力，绘制pH值稳定性曲线。结果表明，该酶保存24 h相对酶活性均在80%以上，说明该酶pH值稳定性较好。见图6。

3.3酶的保存稳定性将制好的粗酶液置于4 ℃冰箱中，定时取样测定酶活性，绘制酶的保存稳定性曲线。结果表明，酶活性随着保存时间的延长下降幅度较小，保存至第10天时相对剩余酶活性仍在85%以上，说明此酶的保存稳定性较好。见图7。

4　讨论

亳菊粗酶液提取过程中，缓冲液的种类和pH值对酶活性影响较大。实验结果表明，亳菊β-葡萄糖苷酶提取时加入pH值为4.0的柠檬酸缓冲液提取效果最好；在对酶活性测定过程中发现，温度、溶液pH值、底物浓度等都会影响其活性。实验结果表明，当酶促反应温度为50 ℃、pH值为4.0、底物浓度为20 mmol/L、反应45 min时酶活性最高。热稳定性实验结果表明，此酶在30～50 ℃下保存稳定，随着温度升高，酶活性有上升趋势。pH值稳定性实验结果表明，pH值稳定性较好，pH值在3.2～5.4之间相对酶活性均在80%以上。保存稳定性实验结果表明，在4 ℃下低温保存，酶的稳定性很好，保存10 d相对剩余酶活性仍然在85%以上。

由于亳菊粗酶液是一个复杂的体系，其中许多夹杂的成分对其酶活性有激发或抑制作用，与纯酶在性质和作用表现上不完全一致。粗酶特性的研究结果并不能代表纯酶的性质，而只能是一个参考，因此有必要对该酶进一步分离纯化并研究其酶学性质。通过研究β-葡萄糖苷酶在亳菊加工过程中对黄酮类化合物的影响，阐明不同加工方法通过影响该酶的活性对亳菊总黄酮化学成分、药效及药物代谢动力学产生影响的原因，通过调节控制炮制加工过程中影响酶活性的因素来控制亳菊中黄酮类有效部位的变化，在根本上保证药材质量，从而为亳菊制定合理的加工方法，为亳菊质量的全面评价和临床使用提供依据。

参考文献：

[1]林慧彬,钟方晓,王学荣,等.菊花的本草考证[J].中医研究,2005,18(1):27-29.

[2]Caldwell CR, Britz SJ, Mirechi RM. Effect of temperature, elevated carbon dioxie, and drought during seed development on the isoflavone content of dwarf soybean [Glycinemax(L.) Merrill] grown in controlled environments[J].J Agric Food Chem, 2005,53(4):1125-1129.

[3]梁迎暖,郭巧生,张重义,等.气象因子对怀菊品质影响分析[J].中国中药杂志,2007,32(23):2474-2478.

[4]梁迎暖,郭巧生,张重义,等.怀菊花期次生代谢物含量及同功酶活性动态变化研究[J].中国中药杂志,2007,32(3):199-202.

[5]李鹏亮,廖若宇,王旭,等.枸杞晒干过程中黄酮类化合物和苯丙氨酸解氨酶活性的变化[J].食品科学,2014,35(23):79-83.

[6]金传山,吴德玲,俞年军,等.不同加工方法对亳菊黄酮类成分含量影响[J].中药材,2012,35(5):702-704.

[7]董尚胜,童启庆.栀子花中糖苷酶的分离及其醇系香气形成的关系[J].浙江大学学报：农业与生命科学版,2000,26(1):89-92.

[8]董尚胜,童启庆，稻垣顺司，等.茶用香花香气形成机理研究报告(2)：茉莉花中β-D-葡萄糖苷酶活性的差异[J].福建茶叶,1998(4):9-10.

[9]赵芹,童启庆.茶叶香气水解酶研究动态[J].福建茶叶，1999(1):5-8.

[10]李华,高丽.葡萄浆果中β-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究[J].酿酒科技,2007(8):146-149.

[11]宋晓青.腊梅花β-葡萄糖苷酶的活性分析、分离纯化与性质的初步研究[D].武汉：华中农业大学, 2005：5.

[12]江昌俊, 李叶云.茶叶中β-D-葡萄糖苷酶活性测定条件的研究[J].安徽农业大学学报,1999,26(2):212-215.

[13]李华,高丽.β-葡萄糖苷酶活力测定方法的研究进展[J].食品与生物技术学报,2007,26(2):107-114.

Extraction and Enzymatic Properties of β-Glucosidase inChrysanthemummorifolium

ZUOYa-feng1,ZHANGWei1,2,3,WUDe-ling2,3,YUNian-jun1,2,JINChuan-shan1,2,LIUJin-song1,2,3,YANPan1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.AnhuiKeyLaboratoryforModernChineseMateriaMedica,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceuticalChemistry,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

Abstract[] ObjectiveTo determine the activity of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium, and to study the fundamental enzymatic properties of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium. MethodsThe p-nitrophenyl-D-glucoside (pNPG) method was used to measure the optimal condition for determination of the activity of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium and its enzymatic properties. ResultsThe β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium had the highest activity when the mixture of 0.2 mL enzyme solution, 0.2 mL pPNG (20 mmol/L), and 0.6 mL citric acid-trisodium citrate buffer (pH 4.0) was incubated for 45 min in a 50 ℃ water bath. The fundamental enzymatic properties of β-glucosidase in the crude enzyme solution of Chrysanthemum morifolium were preliminarily studied under the above condition. The results showed that the enzymatic activity increased as the temperature increased from 30 ℃ to 50 ℃, suggesting a high thermal stability of the enzyme. The relative activity of the enzyme kept higher than 80% at pH 3.2-5.4. The enzyme was quite stable during storage at 4 ℃. ConclusionThe optimal condition for the activity of β-glucosidase in Chrysanthemum morifolium and its enzymatic properties determined in this study provide a basis for the processing principle of Chrysanthemum morifolium.

[Key words]Chrysanthemummorifolium; p-nitrophenyl-D-glucoside method; β-glucosidase activity