我国部分地区H1亚型禽流感病毒分子流行病学分析

刘向明，刘 朔，侯广宇，李金平，庄青叶，王素春，蒋文明，王楷宬，于建敏，单 虎，陈继明

（1. 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2. 中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室，山东青岛 266032）

我国部分地区H1亚型禽流感病毒分子流行病学分析

刘向明1，2，刘 朔2，侯广宇2，李金平2，庄青叶2，王素春2，蒋文明2，王楷宬2，于建敏2，单 虎1，陈继明2

（1. 青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109；2. 中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室，山东青岛 266032）

[目的] 国内外对于H1亚型禽流感病毒缺乏系统的流行病学调查，对其流行状况和风险知之甚少。本研究旨在通过根据流行病学调查，分析该病毒流行状况和风险。[方法] 2011-2013年间，在中国系统地开展了7次H1亚型禽流感病毒流行病学调查，共从24省（自治区、直辖市）949个场点采集38435份禽拭子样品，进行病毒分离、RT-PCR、序列测定等。[结果] 共检出H1亚型禽流感病毒12株（5株H1N2、3株H1N3和4株H1N8），样品总阳性率为0.03%，鸡、鸽、鸭、鹅样品阳性率分别为0.00%（0/28786）、0.00%（0/646）、0.19%（11/5793）和0.06%（1/1131）。基因序列表明，这些病毒均属于东半球分支，均为低致病性禽流感病毒，且仅结合禽型受体。[结论]中国H1亚型禽流感病毒在家禽中感染率较低，主要分布在水禽中，未发现易于结合人型受体的突变，提示H1亚型禽流感病毒对中国家禽和公共卫生威胁较小。

禽流感病毒；流行病学；调查；分布；序列；风险

甲型流感病毒18个HA亚型中，H1亚型谱系比较复杂[1，2]。在1980年以前，这个亚型可以分为h1.1、h1.2和h1.3三大分支，分别对应着H1亚型禽流感病毒（avian infl uenza virus，AIV）、H1亚型人流感病毒和H1亚型猪流感病毒[1，2]。

从20世纪80年代开始，这三大分支的宿主范围逐渐出现一些变化。第一，h1.1分支可以分为h1.1.1和h1.1.2两个二级分支，分别对应着西半球和东半球的H1亚型禽流感病毒；在20世纪80年代，从h1.1.2分支中分化出一个猪流感病毒分支（h1.1.3分支）。第二，h1.2分支在人群中于2010年开始消失，并且这个分支在20世纪90年代，分化出一个猪流感病毒分支（h1.2.5分支）[1，2]。第三，h1.3分支分为h1.3.1分支（1950年后几乎绝迹）和h1.3.2分支；h1.3.2分支从20世纪70年代起，开始零星感染人，并于2009年引起了人流感大流行，并取代h1.2分支，成为人H1亚型人流感病毒[1，2]。经过上述谱系变化，到现在，H1亚型AIV有h1.1.1和h1.1.2两个分支，H1亚型猪流感病毒有h1.3.2、h1.2.5和h1.1.3等三个分支，H1亚型人流感病毒有h1.3.2分支。

在各亚型AIV中，H5和H7亚型有一些毒株属于高致病性AIV，能够引起鸡、火鸡等禽鸟大量发病和死亡[1-6]。近年来，H5和H7亚型AIV还导致出现较多的人间感染病例，引起国际社会高度关注[3-6]。此外，H9亚型的AIV也会引起家禽发病。其他亚型的AIV，包括H1亚型AIV，没有引起人们高度关注，国内外对它们缺乏系统的流行病学调查和风险分析。因此人们对这些亚型AIV的流行状况和风险，知之甚少[1-2]。本研究于2011-2013年间，在中国系统地开展了7次H1亚型AIV流行病学调查，目的是揭示该亚型AIV在中国家禽中的流行状况，分析其流行风险，研究报告如下：

1 材料与方法

1.1 样品采集和处理

2011—2013年，在黑龙江、吉林、辽宁、山东、山西、陕西、河南、宁夏、青海、上海、江苏、江西、安徽、湖北、湖南、浙江、福建、广东、广西、贵州、重庆、四川、云南、海南等24省（自治区、直辖市），随机选择949个场点，共采集38435份家禽拭子样品。其中，鸡、鸭、鹅、鸽咽喉、泄殖腔拭子样品及环境拭子样品，分别为28786、5793、1131、2079和646份。

咽喉、泄殖腔拭子样品采集时，用棉拭子采集活禽咽喉和泄殖腔分泌液，保存于2 ml含10%（v/v）灭菌甘油的PBS离心管中。该PBS含有庆大霉素（250 mg/L）、左旋氧氟沙星（60 mg/L）和阿奇霉素（60 mg/L）。环境样品是用灭菌棉拭子蘸取少许家禽新鲜粪便，放入上述采样溶液而成。

1.2 病毒增殖

将待检测样品10000 g离心10 min，在超净台中将离心后的上清液，通过尿囊腔，接种于发育良好的10日龄SPF鸡胚（购于济南斯帕法斯公司），在35.0℃下孵育4 d，每天观察存活情况，将孵育期内死亡的鸡胚放入4.0℃冷库进行冷藏。孵育4天后，收集所有鸡胚的尿囊液，对存活鸡胚的尿囊液进行血凝试验，然后对所有死亡鸡胚的尿囊液和血凝试验阳性的存活鸡胚的尿囊液，按下述方法提取病毒RNA。

1.3 病毒RNA提取、RT-PCR扩增及序列测定

用病毒RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，德国QIAGEN公司）提取病毒RNA。提取的RNA用引物HA-F（GGGAGCAAAAGCAGGGG）和HA-R （GGAGTAGAAACAAGGGTGTTTT），以及引物NA-1F（GGGAGCAAAAGCAGGAGT）和NA-1413R（GGAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT），分别对病毒HA和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因进行RT-PCR扩增。扩增反应用一步法RT-PCR试剂盒（PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit，大连宝生物工程公司），扩增反应体系为25 μL，反应条件为50℃反转录30 min，94℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，72℃再延伸10 min。产物经毛细管电泳仪检测，阳性样品送至上海生工生物工程公司测序。有些扩增产物连接于PMD19-T载体上，进行克隆测序。

1.4 序列谱系分析和变异分析

用DNAStar软件中的Seqman程序对测定的序列进行拼接，拼接后的序列与AIV各亚型标准的HA序列进行比对，确定亚型。序列的谱系分析时，将H1亚型AIV代表株序列与本研究获得的毒株序列一起，用MEGA 5.0分析软件包进行序列比对和谱系分析[7]。先用其中的Muscle软件进行Bayesian Information Criterion分值计算，然后选取BIC分值最低的模型按照最大似然法（maximum likelihood）进行谱系关系运算，bootstrap值按1000个循环计算。根据前人研究结果[1]，以及基因的谱系关系的运算结果和遗传距离，进行谱系划分。依据前人对HA基因变异研究结果，解析HA基因变异的生物学意义[6]。

1.5 统计检验

如果未特别说明，本文统计检验用卡方检验，P小于0.05说明差异显著。

2 结果

2.1 样品检测结果

经过鸡胚分离、RT-PCR检测、序列测定，在38435份样品中，检出2903株AIV。其中12株为H1亚型AIV，占AIV总数0.41%，H1亚型AIV样品总阳性率为0.03%。这12株H1亚型AIV中，有5株H1N2、3株 H1N3、4株 H1N8，其中11株病毒来源于鸭子，1株来源于鹅。从28786份鸡拭子样品、2079鸽拭子样品和646份环境样品中，都没有检出H1亚型AIV（表1）。

2.2 基因谱系分析和变异分析

对上述12株H1亚型AIV的HA基因序列已经提交到GenBank（收录号为KP658027-KP658030、KP658032-KP658034、KP658036-KP658040）。对这些序列进行谱系分析，如图1所示，这12株H1亚型AIV都属于H1亚型AIV东半球分支（h1.1.2分支），与北美分支（h1.1.1分支）同一时期的病毒在HA基因氨基酸序列上差异率达到3.96%，而此期h1.1.2分支和h1.1.1分支内部HA基因氨基酸序列上差异率分别为2.00%和1.19%。

表1 2011-2013年H1亚型AIV流行病学调查样品检测结果

图1 近年来H1亚型禽流感病毒HA基因谱系关系

本研究检出的病毒用三角号标记。它们都属于h1.1.2分支。图中“AGW-teal”是“American green winged teal” 的 缩 写， 而“AB-duck” 是“American black duck”的缩写。

上述12株H1亚型AIV的HA基因在HA1和HA2裂解位点处的氨基酸序列为PSVQSR↓GLF（4株）或PSIQSR↓GLF（8株），都只含有一个碱性氨基酸，是典型的低致病性禽流感的特征，所以12株病毒均为低致病性AIV。

上述12株H1亚型AIV的HA1区域中与受体结合有关的位点（98、134、138、153、183、190、194、225、226、228，按照H3亚型HA1氨基酸序列进行定位）都未发现有任何能够结合人型受体的变异，都呈现典型的结合禽型受体的序列特征（包括190E、225G、226Q和228G）[6]。

3 讨论

本研究通过对38435份样品的检测，发现H1亚型AIV占检出AIV总数的0.41%，约为16个亚型AIV平均比重（6.25%）的1/15。这说明H1亚型AIV在各亚型AIV中，不具有流行优势。

本研究开展的7次流行病学调查发现的H1亚型AIV都来自水禽，而大量的鸡、鸽等旱禽样品中，没有检出H1亚型AIV，说明在我国主要分布在水禽中。

本文对AIV的HA基因变异进行了分析，发现本研究检出的12株AIV都没有发生易于感染人型受体的突变，提示这些病毒难以结合人型受体，难以感染人，所以它们对人的威胁不大[6]。虽然禽流感病毒其他基因，如PB2基因，发生某些变异，也会增加该病毒对人的侵袭力，但是这类变异如果没有病毒受体结合特性方面的突变的配合，对人的威胁较小[6]。

H1亚 型AIV可 以分 为h1.1.1和h1.1.2两个分支，分别对应着西半球和东半球的H1亚型AIV[1]。本研究通过监测发现的12株H1亚型AIV全部属于h1.1.2分支，符合该亚型AIV的地理分布规律。

总之，本研究首次在中国持续数年开展H1亚型AIV大规模病原学监测，监测数据表明中国H1亚型AIV在家禽中感染率较低，主要分布在水禽中，谱系上属于东半球的分支，并且该病毒目前没有发生易于感染人型受体的突变。这些结果提示H1亚型AIV对家禽和公共卫生威胁较小。

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Epidemiological Surveys of H1 Subtype Avian Infl uenza Viruses in China during 2011—2013

Liu Xiangming1，2，Liu Shuo2，Hou Guangyu2，Li Jinping2，Zhuang Qingye2，Wang Suchun2，Jiang Wenming2，Wang Kaicheng2，Yu Jianmin2，Shan Hu1，Chen Jiming2
（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109; 2. Laboratory of Avian Disease Surveillance，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

[Objective] H1 subtype avian infl uenza viruses （AIVs） have been seldom investigated，and their circulation and risk remain unknown. In the study，epidemiological surveys were conducted to analyze the circulation and risk of the viruses. [Methods] Seven systematical surveys of H1 subtype AIVs in China in 2011-2013 were conducted，with the collection of 38435 swab samples from 949 sites in 24 provinces （autonomous regions and municipalities）. The samples were detected by means of virus isolation，RT-PCR and sequencing. [Results] A total of 12 H1 subtype AIVs （5 H1N2，3 H1N3 and 4 H1N8） were detected from the swab samples with the general prevalence of 0.03%. The virus prevalence in chicken，duck，goose and pigeon samples were 0.00% （0/28786），0.00% （0/646），0.19% （11/5793） and 0.06% （1/1131）. These 12 viruses all belonged to the viral Eastern-Hemisphere clade，and were all low pathogenic without any mutations associated with increased binding to human-like receptors. [Conclusion] These data suggested that H1 subtype AIVs mainly circulated in waterfowls and were of low prevalence in the poultry in China，and they were of low risk to the poultry and public health.

avian infl uenza virus；epidemiology；survey；distribution；sequence；risk

S858.3

B

1005-944X（2015）05-0001-04

单虎，陈继明