小干扰RNA沉默骨桥蛋白对球囊损伤大鼠颈动脉后基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶-14的影响*

徐健，冯丰，刘闺男

(1.辽宁省沈阳市第一人民医院心血管内科，辽宁 沈阳 110041；2.中国医科大学附属第一医院心血管内科，辽宁 沈阳 110001)

·论著·

小干扰RNA沉默骨桥蛋白对球囊损伤大鼠颈动脉后基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶-14的影响*

徐健1，冯丰1，刘闺男2

(1.辽宁省沈阳市第一人民医院心血管内科，辽宁 沈阳 110041；2.中国医科大学附属第一医院心血管内科，辽宁 沈阳 110001)

目的观察经动脉外膜转染骨桥蛋白（OPN）的小干扰RNA对大鼠颈动脉损伤后内膜增生及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-14（MMP-14）表达的影响，并初步探讨OPN-siRNA-002抑制球囊损伤后内膜增生的机制。方法以前期细胞实验筛选出的最敏感的OPN-siRNA-002序列作为动物实验转染基因，在转染试剂聚醚胶介导下，经血管外膜转染OPN-siRNA-002，于术后不同的实验终点处死大鼠，检测内膜增生程度及OPN、MMP-2、MMP-14的表达变化，以及OPN-siRNA-002对它们的抑制作用。结果OPN-siRNA-002组内膜增生显著减轻，OPN、MMP-2、MMP-14的表达减少，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。结论OPN-siRNA-002可能通过特异性抑制OPN的表达，进而抑制MMP-2、MMP-14的表达，减轻血管损伤后内膜的增生。

骨桥蛋白；小干扰RNA；血管再狭窄；基因转染；大鼠

随着生活节奏的加快，生活方式的改变及人口老龄化，冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的发病率也愈来愈高，成为造成死亡的主要原因之一。近几十年来，随着冠状动脉内介入技术的不断成熟与发展，越来越多的冠心病患者都得到有效治疗。但经皮冠状动脉成形（percutaneous transluminal coronaryangioplasty，PTCA）术后再狭窄（restenosis，RS）的发生严重地影响其远期疗效。上世纪90年代中期以来进行包括PTCA、冠脉斑块切除、斑块旋切和激光血管成形术等腔内物理治疗的临床试验，但其预防和治疗效果令人失望[1-4]。目前多数学者认为，RS包括内膜增生、血管重塑和血栓形成3个相互联系而又独立的环节[5]。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中一种重要的功能性蛋白，在大鼠血管损伤的增生内膜中，它的表达迅速明显增加，调节血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖和迁移，因而被认为是VSMC表型转化的标志性基因[6]。有大量实验证明，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一类蛋白酶家族，血管损伤后表达明显增加，在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）增厚的内膜中表达水平显著增加，并与病变程度相关[7]。本文拟通过球囊损伤的方法制备大鼠颈动脉内膜损伤模型，在体局部转染OPN-siRNA，观察转染OPN-siRNA对损伤血管局部OPN的表达、MMPs的表达及抑制血管内膜增生的作用，来初步探讨OPN-siRNA抑制血管内膜增生的可能机制，从而为基因治疗RS提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大白鼠由中国医科大学实验动物中心提供，导管2 F Fogarty购自美国Baxter health corporation，OPN兔抗大鼠多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology USA，MMP-2、MMP-14兔抗大鼠多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，总RTPCR提取试剂盒、RT-PCR逆转录试剂盒、RT-PCR引物购自大连宝生物工程有限公司，根据GeneBank信息，确定大鼠OPN cDNA序列（NM_012881），合成3对可能有效的OPN-siRNA（委托广州锐博生物科技有限公司合成）。通过笔者之前的研究[8]，应用实时RT-PCR检测OPN-mRNA的表达水平，选择其中沉默效果最好的siRNA序列-Si-r-OPN_002，进行动物实验。正向引物：（5'-3'）5'-GGAUGAAUC UGACGAAUCUDTDT-3'；反向引物：（3'-5'）3'-DTDT CCUACUUAGACUGCUUAGA-5'。

1.2 方法

1.2.1 实验分组72只Wistar大白鼠随机分为4组，每组18只。①假手术组：分离出左颈总动脉后，不作球囊拉伤处理；②聚醚对照组：左颈总动脉球囊拉伤后，30%的聚醚（pluronic）200μl凝胶溶液注射于颈动脉损伤部位周围；③OPN-SCR-siRNA对照组：左颈总动脉球囊拉伤后，含OPN-scramble-siRNA 15μg的30%聚醚胶（pluronic gel）的200μl溶液注射于颈动脉损伤部位周围；④OPN-siRNA-002治疗组：左颈总动脉球囊拉伤后，含OPN-siRNA-002 15μg的30%pluronic gel的200μl溶液注射于颈动脉损伤部位周围。

1.2.2 大鼠颈动脉损伤模型的建立Wistar大鼠，体重350～400 g，10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉后，颈正中切开，钝性分离左颈总动脉，用血管夹临时阻断左颈总动脉近心、远心端血流，应用2 F Fogarty球囊导管从颈外动脉插入左颈总动脉内，注入生理盐水，反复全程抽拉球囊，重复3次，造成左颈总动脉内膜损伤。术后结扎颈外动脉，恢复血流。分别于术后的不同的实验终点分批处死动物。取出左颈总动脉，分别置于4%多聚甲醛和液氮中，用于HE染色、免疫组织化学、Western blot及实时RT-PCR检测。

1.2.3 在体OPN-siRNA转染左颈总动脉球囊拉伤后，结扎颈外动脉，将200μl转染复合物（含有Cy3-OPN-SCR-siRNA 15μg的30%pluronic gel溶液）注射于颈动脉损伤部位周围，缝合颈部创口。转染72 h后，即取大鼠损伤段局部血管，放入液氮罐中，制成冷冻切片（片厚5μm），避光置于荧光显微镜下。

1.2.4 血管病理形态学检测病变血管标本经石蜡包埋后，从每段血管的横截面随机切下3张切片后，利用HE染色在光学显微镜下观察其内膜增生情况，并利用计算机图像分析系统，检测血管内膜、中膜厚度的改变，计算内膜/中膜（I/M）的面积比。

1.2.5 免疫组织化学检查将颈总动脉制成4μm的切片，采用SABC法进行免疫组织化学染色，加DAB显色，苏木素复染。以胞浆见棕黄色颗粒为阳性，一组切片标本用PBS代替一抗作为空白对照组。

1.2.6 实时RT-PCR法检测血管壁组织的OPN、MMP-2和MMP-14 mRNA表达采用Trizol一步法提取颈总动脉的总RNA。取各组总RNA 3μl逆转录合成cDNA，逆转录反应根据逆转录试剂盒要求的标准进行，反应总体积为20μl，反应条件为37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、7 min。应用ABI 7500扩增仪进行PCR扩增反应，20μl反应体系组成如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2X）10μl，PCR正向引物（10μmol）0.8μl，PCR反向引物（10μmol）0.8μl，ROX Reference DyeⅡ0.4μl，cDNA模板2μl，dH2O 6μl。反应条件为：95℃活化30 s，95℃变性5 s，然后60℃退火和延展30 s，共40个循环。引物序列和扩增产物长度见表1。β-肌动蛋白作为参考。按2-△△（T）法计算目的基因相对于对照基因的表达量[9]。实验重复3次，取均值。

1.2.7 Western blot法检测血管壁组织的OPN、MMP-2和MMP-14的蛋白表达提取各组动脉总蛋白后，并将蛋白浓度调至同一水平，每孔加样80μg，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗OPN（1∶400）、MMP-2（1∶400）和MMP-14（1∶400），4℃孵育过夜。洗膜3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育，显色2～5 min，凝胶成像分析系统测定条带的平均积分光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，运用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 实时RT-PCR引物序列和扩增产物长度

2 结果

2.1 在体OPN-siRNA转染效果观察

转染Cy3标记的SCR-siRNA 72 h后，将转染局部血管制成5μm厚的冷冻切片置于荧光显微镜下，可以发现，残存血管外膜下、中膜及内膜下均有红色荧光分布，以中膜最为明显，说明转染效果满意（见图1）。

图1 在体OPN-siRNA转染效果（×400）

2.2 血管病理形态学检测结果

假手术组的血管内膜光滑、完整；而在球囊损伤并且给予30%Pluronic gel的对照组和转染OPNSCR-siRNA对照组14 d，其内弹力板消失，内膜明显增生。转染OPN-siRNA-002与同一时间点对照组相比，内膜增生受到显著抑制，差异有统计学意义（P＜0.001）。各组血管新生内膜与中膜面积比见图2和表2。

图2 OPN-siRNA-002对球囊损伤后新生内膜增生的影响

2.3 免疫组织化学染色结果

假手术组血管壁内膜和中膜胞浆内见微弱黄色颗粒，而血管球囊损伤后3、7及14 d，均出现棕黄色颗粒，主要分布于中膜及增厚的内膜的细胞浆及细胞外基质中，MMP-14第3天最强，MMP-2第7天最强；OPN第14天最强。OPN-siRNA-002治疗组在各个时间点的中膜和内膜亦出现棕黄色颗粒，但较两对照组明显减轻（P＜0.01）。见图3。

表2 血管球囊损伤后血管内膜、中膜面积比（n=6，mm2±s）

表2 血管球囊损伤后血管内膜、中膜面积比（n=6，mm2±s）

注：I为新生内膜面积，M为中膜面积，I/M为内膜面积与中膜面积比值。1）与假手术组比较，P＜0.01；2）与两对照组比较，P＜0.01

组别指标术后7 d术后14 d假手术组新生内膜面积00中膜面积0.131 5±0.012 70.132 5±0.012 7聚醚对照组新生内膜面积0.098 5±0.006 01）0.132 7±0.015 21）中膜面积0.133 3±0.006 20.131 7±0.008 1 I/M0.740 5±0.030 01）1.009 0±0.116 51）OPN-SCR-siRNA对照组新生内膜面积0.095 8±0.005 71）0.128 7±0.009 81）中膜面积0.129 0±0.005 70.132 0±0.005 9 I/M0.744 3±0.057 41）0.978 0±0.107 41）OPN-siRNA-002治疗组新生内膜面积0.041 0±0.004 82）0.065 2±0.009 92）中膜面积0.130 3±0.00420.125 0±0.015 5 I/M0.314 4±0.033 52）0.521 0±0.042 72）

图3 OPN、MMP-2及MMP-14免疫组织化学染色结果（×400）

2.4 实时RT-PCR检测

在假手术组，OPN、MMP-2、MMP-14 mRNA仅微弱表达；血管球囊损伤后，OPN、MMP-2、MMP-14 mRNA表达明显升高；MMP-14 mRNA第3天达高峰，第14天时恢复正常水平；MMP-2 mRNA表达第7天达高峰，OPN mRNA表达第14天达高峰。经OPN-siRNA治疗后，同一时间点OPN、MMP-2、MMP-14 mRNA表达明显减少（见图4），与SCR-siRNA转染及聚醚对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

图4 实时RT-qPCR分析大鼠颈动脉损伤OPN、MMP-2 and MMP-14 mRNA表达（n=6）

图5 Western blot分析大鼠颈动脉OPN、MMP-2与MMP-14蛋白表达水平，Actin作为内参

2.5 Western blot检测

在假手术组，OPN、MMP-2、MMP-14有微弱的蛋白条带表达；然而，血管球囊损伤后3、7及14天后，OPN、MMP-2、MMP-14蛋白条带灰度逐渐增加，MMP-14第3天最明显，MMP-2第7天最明显，OPN第14天最明显。经OPN siRNA治疗后，同一时间点OPN、MMP-2、MMP-14表达明显减少（见图5），与OPN-SCR-siRNA转染及聚醚对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）见表3。

表3 血管组织OPN、MMP-2、MMP-14蛋白表达（积分光密度比值，n=6±s）

表3 血管组织OPN、MMP-2、MMP-14蛋白表达（积分光密度比值，n=6±s）

注：1）与假手术组比较，P＜0.01；2）与两对照组比较，P＜0.01

组别第3天第7天第14天OPN假手术组0.187 6±0.015 6 0.190 2±0.018 4 0.189 3±0.018 1聚醚对照组0.35 6±0.039 81）0.566 1±0.046 31）0.819 5±0.043 01）OPN-SCR-siRNA对照组0.359 2±0.029 11）0.550 1±0.046 61）0.804 4±0.050 71）OPN-siRNA-002治疗组0.201 1±0.024 02）0.322 5±0.034 22）0.430 6±0.042 62）MMP-2假手术组0.165 7±0.015 8 0.166 2±0.016 1 0.164 8±0.015 0聚醚对照组0.359 4±0.033 31）0.584 3±0.070 31）0.501 1±0.052 81）OPN-SCR-siRNA对照组0.362 5±0.031 01）0.578 7±0.051 81）0.496 1±0.042 21）OPN-siRNA-002治疗组0.192 1±0.018 52）0.329 2±0.026 92）0.303 0±0.026 92）MMP-14假手术组0.169 3±0.017 4 0.168 1±0.017 1 0.162 8±0.017 6聚醚对照组0.6176±0.08331）0.359 4±0.033 31）0.176 6±0.017 5 OPN-SCR-siRNA对照组0.612 0±0.055 11）0.362 5±0.031 01）0.178 1±0.019 2 OPN-siRNA-002治疗组0.318 0±0.031 12）0.188 8±0.018 52）0.169 1±0.018 4

3 讨论

EMC是血管损伤后新生内膜的主要成分，在PTCA后发生RS的新生内膜中，EMC的含量超过50%[10]，因此，EMC是血管再塑形的主要元素，也是形成RS的主要物质。研究发现，许多参与经皮冠状动脉介入治疗（percataneous coronary intervention，PCI）术后RS的细胞因子都能够刺激VSMC过度表达OPN[11-12]。应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的表型转化、迁移和增殖[13]。前期的研究也证明，使用针对大鼠OPN的反义核苷酸抑制OPN的表达后，可明显抑制VSMC的增殖[14]，均表明以OPN为靶点在防治RS发生方面的重要作用。

鉴于siRNA转染过程中容易受核酸的消化作用的影响，半衰期较短，研究人员对siRNA进行甲基化修饰，使其在细胞核内长期稳定存在。转染途径的选择是决定siRNA效果的另一重要因素，血管壁基因转移可经血管腔内和血管外膜两种途经。本研究受到WANG等[15]在血管外膜成功转染siRNAADAMTS-7方法的启示，探讨血管损伤后，经血管外膜转染OPN-siRNA抑制血管内膜增生的作用。为了证实经血管外膜的转染效果，本研究应用Cy3-SCR-siRNA，于损伤和转染后第3天，取出局部血管并制成冰冻切片，可以发现，残存血管外膜下、中膜及内膜下均有红色荧光分布，以中膜最为明显，说明转染效果满意。实验结果也表明，转染后第7天，不仅OPN的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比出现了明显的下调，而且其内膜增生的程度也被明显地抑制，而且这种抑制作用一直持续到实验结束的第14天。

NAGASE[16]认为MMP-2在细胞的迁移中起到关键作用，MMP-14、MMP-2酶原、TIMP-2在细胞表面形成三元络合物，调节MMP-2的激活，降解ECM，促进细胞迁移。ECM，尤其是基底膜，是VSMC迁徙必需战胜的生理屏障，其合成及降解失衡并沉积于动脉壁是AS、RS等病变加重的一个关键环节[17]。ECM合成及降解，以及平滑肌的迁移、增生都取决于MMPs和其组织抑制剂TIMPs之间的动态平衡[18]。MMPs由VSMC、巨噬细胞及其他一些细胞产生，是降解VSMC基底膜基质的主要酶类，导致血管VSMC由中膜向内膜迁移并增生，进一步分泌大量ECM，从而促进内膜增生、血管重构，最终导致RS的发生[19]。抑制MMPs活性可能降低RS的程度，其中尤以MMP-2最为重要，KUZUYA等[20]用MMP-2基因敲除小鼠进行实验，在动脉损伤模型中发现内膜增生程度比野生型小鼠明显减轻，VSM迁移能力显著下降。MMP-14是一类特殊的蛋白酶，研究认为其以无活性的MMP-2为作用底物，将其氮端剪切掉，成为中间活化状态，进而转变成完全活化的MMP-2，参与其酶原的激活反应；由于分布在细胞表面，人们认为其在细胞迁移中的作用更为重要[21-22]。

本研究表明，血管内膜损伤后MMP-14和MMP-2表达增加，MMP-14在第3天达高峰，MMP-2在第7天达高峰，经OPN-siRNA-002治疗后表达相应减少。考虑可能OPN-siRNA-002阻断下游细胞迁移相关基因MMP-14转录激活，从而也间接抑制了MMP-14激活MMP-2促进细胞迁移的作用。这与先前的一项体外研究应用OPN刺激VSMC的增生可以提高MMPs的活性一致[23]。而且另一项体外研究也显示，OPN刺激MMP-2的激活是通过NF-κB介导的MMP-14的诱导产生，OPN诱导MMP-2生成在转录水平得到调控[24]。这些都支持OPN在血管再狭窄的发生中扮演着主角作用。

总之，此次研究成功地证明经血管外膜转染OPN-siRNA能够显著降低颈动脉损伤后OPN的表达，抑制细胞迁移的相关基因MMP-14及MMP-2的表达，减轻新生内膜的形成。该研究为临床治疗RS提供一定实验基础及理论依据，进一步的研究还在进行中。

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（张蕾 编辑）

Effects of osteopontin-small interfering RNA on expressions of MMP-2 and MMP-14 after balloon injury of rat carotid artery*

Jian XU1,Feng FENG1,Gui-Nan LIU2
(1.Department of Cardiology,the First People's Hospital of Shenyang,Shenyang,Liaoning 110041,P.R.China;2.Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital, China Medical University,Shenyang,Liaoning 110001,P.R.China)

【Objective】To investigate the effects of perivascular osteopontin-small interfering RNA(OPN-siRNA)transfer on neointima formation and MMP-2 and MMP-14 expressions after balloon injury of rat carotid artery and to explore the possible mechanism of inhibiting neointima formation.【Methods】The most sensitive OPN-siRNA-002 sequence was chosen by real-time RT-PCR in the previous experiment and used as transfection siRNA in the subsequent animal experiments,then perivascularly transfected with 30%pluronic gel.Six rats of each group were killed at different experimental endpoints after balloon injury.Hematoxylineosin(HE),immunohistochemistry,real-time RT-PCR and Western blot were used to evaluate neointima and the expressions of MMP-2 and MMP-14,and the role of OPN-siRNA on them was also studied.【Results】The neointimal thickness and mRNA and protein expressions of OPN,MMP-2 and MMP-14 were significantly decreased in the OPN-siRNA-002 group at each time point compared to those in the control group(P＜0.001).【Conclusion】OPN-siRNA-002 can inhibit intimal hyperplasia after artery injury by inhibiting the expressions of OPN,MMP-2 and MMP-14.

osteopontin；siRNA；restenosis；transfection；rat

R363；R-332

A

1005-8982（2015）30-0001-06

2015-01-29

沈阳市科技局立项项目（No：F13-220-9-32）