温度对血凝和血凝抑制试验的影响

陈 华

(江苏省淮安市金湖县动物疫病预防控制中心,江苏淮安 211600)

温度对血凝和血凝抑制试验的影响

陈 华

(江苏省淮安市金湖县动物疫病预防控制中心,江苏淮安 211600)

禽流感病毒、新城疫病毒能够与鸡红细胞发生凝集(HA)现象,这种红细胞凝集现象可被特异性抗血清所抑制(HI)。血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验可以用来鉴定病毒亚型,也可以用来判定疫苗免疫效果。现就20～25℃、37℃对血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验的影响作个比较。

血凝抑制试验;影响

1 材料与试剂

（1）96孔V型微量血凝移液器（配有滴头）、微量振荡器、普通离心机

（2）试剂 0.85%灭菌生理盐水、新鲜1%鸡红细胞悬液、标准禽流感H5病毒抗原、标准禽流感H5阳性血清、50份待检鸡血清。

2 操作方法和结果判定

（1）20～25℃下血凝（HA）试验：测标准禽流感H5病毒抗原的血凝价。

①在V型微量反应板的1孔---12孔均加入0.025ml生理盐水。

②吸取0.025ml H5病毒悬液，加入第1孔，混匀。

③从第1孔取0.025ml病毒悬液加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之。

④每孔再加入0.025ml生理盐水。

⑤每孔均加入0.025ml充分摇匀的1%鸡红细胞悬液。

⑥震荡混匀，在20～25℃下静置40分钟后观察结果。

⑦结果判定：观察红细胞，对照红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底，将血凝板倾斜，有泪滴状流淌3孔，判定该标准禽流感H5病毒抗原的血凝价为29。

（2）20～25℃下血凝抑制（HI）试验：测待检血清的H5血凝效价。

①根据HA试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数29作为终点，29除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数，即以1：128稀释后即为4HAU抗原。

②在微量反应板的1孔～11孔加入0.025ml、第12孔加入0.05ml生理盐水。

③吸取0.025ml血清加入第1孔内，充分混匀后吸取0.025ml，于第2孔依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃之。

④1～11孔加入含4HAU的H5病毒抗原液0.025ml，震荡混匀，于室温（约20～25℃℃）静置30民，

⑤每孔加入0.025ml1%红细胞悬液，震荡混匀，室温（约20～25℃）静置40min。

⑥结果判定：将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪滴状流淌。对照阴阳性血清孔效价，以完全抑制4个HAU抗原的血清最高倍数作为HI滴度。50份待检血清的H5血凝价见下表：

⑦判定结果后，继续将血凝板放室温（约20～25℃）中，每隔15min，观察试验变化。随着时间的不断延长，红细胞泪滴状流淌越来越清淅，最后红细胞完全解脱。

（3）37℃下血凝（HA）试验：测标准禽流感H5病毒抗原的血凝价。

步骤①②③④⑤同（1）

⑥震荡混匀，在37℃下静置15min后观察结果。

板号 样品编号 血凝价 备注 板号 样品编号 血凝价 备注1 274 1 26 262 28 27 263 28 28 274 28 29 295 27 30 296 27 31 287 27 32 288 2833 289 26 34 2710 26 35 2911 26 36 2912 26 37 2913 26 38 2914 28 39 21015 28 40 2916 285 2 41 2949 294 25 28 50 293 17 27 42 2918 27 43 2819 27 44 2920 27 45 2821 28 46 2922 27 47 2923 28 48 2824 287 6

⑦结果判定：观察红细胞，对照红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底，将血凝板倾斜，有泪滴状流淌3孔，判定该标准禽流感H5病毒抗原的血凝价为29。

（4）37℃下血凝抑制（HI）试验：测待检血清的H5血凝效价。

步骤①②③同（2）

④1～11孔加入含4HAU的H5病毒抗原液0.025ml，震荡混匀，37℃静置15min。

⑤每孔加入0.025ml1%红细胞悬液，震荡混匀，37℃静置15min。

⑥结果判定：将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪滴状流淌。对照阴阳性血清孔效价，以完全抑制4个HAU抗原的血清最高倍数作为HI滴度。50份待检血清的血凝价见下表：

（备注中+1、-1表示与20℃-25℃时血凝价的差异）

⑦判定结果后，继续将血凝板放入37℃温箱中，每隔15分钟，观察血凝价的变化。很快红细胞就出现解脱。

3 结果分析

①在室温（20～25℃）和温箱（37℃）这两种不同温度下，50个样品中，只有6个样品的滴度变化在1个滴度内。因此血凝和血凝抑制试验结果在这两个温度下没有显著差别。

②在室温（20～25℃）条件下，HI滴度随作用时间的延长而升高，温度低，递增慢，达到HI最高值的所需时间长；试验判定等待时间较长（40min），而在温箱（约37℃），温度高，HI滴度递增快，达到最高值所需时间短。试验判定等待时间较短（15min）。

③室温（20～25℃）条件下，试验结果维持的时间长，不易引起因红细胞解脱而影响结果判定。37℃时，若不及时从温箱中拿出血凝板，很容易因温度高时间长而出现红细胞解脱，影响试验结果判定。

③在血清样品数较少、需要快速诊断抗体水平时，可将试验温度调到37℃。在这个温度下，可快速得出血清的抗体水平，有助于提高工作效率。

④在血清样品数较多、不需要快速诊断抗体水平时，可将试验温度调到25℃。在这个温度下，较多的样品判定结果时，不会因判定持续时间较长而影响结果。

[1] 李晓华.血凝抑制试验的影响因素[J].龙岩学院学报，2004，（3）：78.