金钗石斛DnMSI1-like基因的克隆和表达分析

陈莉莉，郭无瑕，潘 婷，刘小如，曹孟艳，王亚琴，梁 山

(广东省植物发育工程重点实验室，华南师范大学生命科学学院，广州510631)

MSI1-like (MSIL)蛋白是一类在真核生物中保守的组蛋白结合蛋白，包括面包酵母中的ScMSI1，果蝇中的p55，人类的RbAp46/48，拟南芥AtMSI1 ～5，水稻OsRBAP1 ～3 等［1］.这些蛋白可直接或间接与组蛋白结合，比如在核小体组装前结合在H4 组蛋白的螺旋-1 上，或结合于H3-H4 二聚体或四聚体上，从而调控生物体分化和发育. 单细胞酵母的MSIL 基因失去功能时没有明显的突变表型，而多细胞真核生物的MSIL 蛋白失去功能会引起多种特定的表型缺陷，甚至致死. 比如，模式植物拟南芥的msi4(即fve)突变体表现为晚花表型［2］;而msi1 表现出纯合致死，其杂合突变体则表现出种子发育异常［3-4］或晚花表型［5］.超表达RbAp46 的人类细胞的肿瘤发生被抑制，暗示这一个MSIL 蛋白参与细胞增殖的调控.而在果蝇中，p55 蛋白则主要在细胞分化而不是细胞增殖的控制方面起作用.

拟南芥的AtMSI1 是多梳抑制性复合体2(Polycomb Repressive Complex 2，PRC2)的重要组分之一.PRC2 复合体在动物、植物中保守［6-7］.在拟南芥中，PRC2 复合体使H3 组蛋白第27 位赖氨酸三甲基化，抑制靶基因的表达［7］.拟南芥至少有3 种PRC2 复合体，包括EMF2-PRC2，VRN2-PRC2 和FIS2-PRC2 复合体，参与成花转变、花发育、受精和种子发育过程的调控［7］.与其酵母和哺乳动物同源物类似，拟南芥AtMSI1 是一个WD-40 蛋白，其C-端含有5个连续的WD-40 结构域，而N-端则为一个CAF1C_H4结合结构域，介导与组蛋白的结合，参与染色质重建和核小体的组装［1］. 拟南芥msi 纯合突变体表现为种子发育障碍，其杂合体也仅有一半的种子正常发育;在AtMSI1 功能被部分补偿的突变体中，虽然种子发育良好，但开花期明显延迟［5］. AtMSI4 即FVE蛋白被认为是开花调控的自主途径中的一个关键成分;在fve 突变中FLC 染色质的乙酰化程度提高，植株开花被抑制［2，8-9］.

金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)属于兰科石斛属，为观赏和药草两用植物. 其花型大而美丽，常在春石斛品种培育中用作杂交母本. 金钗石斛需要经过一段时间的低温刺激，方可在春暖时开花［10］.本研究组在前期对金钗石斛开花调控的研究中，收集金钗石斛人工春化处理(昼夜温度分别为16 ℃和10 ℃)不同时间的腋芽建立了cDNA 文库并进行文库测序.由测序获得的序列建立了金钗石斛的EST 数据集［11］，其中包含了MSIL 家族成员的EST 序列.根据该序列信息，本研究克隆分离了1个金钗石斛的MSIL(MSI-like)家族基因的全长cDNA序列，并对其基因表达进行了检测，为后续发掘其功能和培育良种花卉打下基础.

1 方法与材料

1.1 植物材料

金钗石斛购于云南，种植在华南师范大学国兰中心的温室大棚中.10月，取封顶的成年苗在自然光下进行人工春化处理，昼夜温度分别为16 ℃和10 ℃.收集不同时间处理的腋芽，液氮急冻后，于-80 ℃保存备用.

1.2 RNA 抽提和逆转录

金钗石斛腋芽总RNA 的抽提方法参照陈敏燕等［12］的方法. 使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit (宝生物，大连)按照说明书进行逆转录获得cDNA.

1.3 RACE 扩增全长cDNA

根据前期工作中收集的EST 序列库中的MISL基因的序列设计特异引物，通过3'RACE 和5'RACE进行cDNA 末端扩增.经过克隆测序后，根据所得序列设计特异引物，通过PCR 扩增获得全长cDNA 序列.

1.4 序列分析

利用NCBI 网站上的公共数据库，采用BlastX搜索与金钗石斛DnMSI1-Like 蛋白的同源蛋白，在E-value ＜=10-20的搜索结果中选择单子叶、双子叶和被子植物进化基部的代表性物种的同源蛋白，并将相应的核苷酸和蛋白质序列下载至本地. 利用LaserGene 软件包中的Megaligne 进行序列比对，输出的结果被加载到TreeView 上进行查看和分析.蛋白质空间构象使用SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)［13-15］预测.

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 定量PCR

采用SYBR® Premix Ex TaqTM(宝生物，大连)预制混合液，按照使用说明书加入适量的引物和0.2 μL 的逆转录产物(1 μg 总RNA 作为起始模板，20 μL 的反应体系)，在ABI7500 上通过试剂盒推荐的程序进行定量PCR 反应. 每个样品设置3个重复.反应结束后，使用ABI7500 自带的软件进行结果的初步分析和原始结果的输出，用Excel 进行进一步的结果分析和作图.

2 结果与分析

2.1 DnMSI1-like 的克隆和序列分析

根据前期所获得的EST 文库［11］中MSIL 家族成员的序列信息，通过RACE 扩增获得了1 条长度为1 640 bp 的MSI1-like cDNA 序列;经DNA 序列测定及BlastX 比对表明，该序列含有长度为1 206 bp 的开放阅读框，具有编码拟南芥MSI1 同源蛋白质的潜能，将该序列命名为DnMSI1-like. 根据该序列的开放阅读框设计特异引物，从金钗石斛腋芽中采用逆转录PCR 扩增其编码区，回收PCR 扩增产物，纯化后测序表明所得序列长度和核苷酸顺序符合预期，确定为DnMSI1-like 蛋白的编码区序列(图1A).

DnMSI1-Like 蛋白由401个氨基酸残基组成(图1C)，与拟南芥的AtMSI1 蛋白的序列一致性达到88%.蛋白结构域预测表明，DnMSI1-like 的N-端含有CAF1C_H4-bd 结构域;而与拟南芥MSI1 蛋白不同的是，DnMSI1-like 的C-端仅含有4个完整的WD40 结构域外，最靠近C-端的是1个不完整的WD40 结构域.这种结构域的组织特征与拟南芥At-MSI3 蛋白类似. SWISS-MODEL(http:∥swissmodel.expasy.org/)分析表明AtMSI1 与DnMSI1-like 具有类似的空间结构，DnMSI-like 的C-末端被隐藏在内部，而AtMSI1 的C-端则裸露(图1B).

图1 DnMSI1-like cDNA 及其推导的蛋白质Figure 1 DnMSI1-like cDNA and the deduced protein

2.2 金钗石斛DnMSI1-like 蛋白的系统演化

以金钗石斛DnMSI1-like 蛋白序列为查询项，通过Blastp 在NCBI 的拟南芥、水稻、酵母等物种的蛋白质数据库以及非冗余蛋白质数据库搜索，获得部分单子叶、双子叶和基部物种的同源蛋白序列;此外，从Phytozome v10 数据库获取了卷柏、小立碗藓和绿色鞭毛藻的同源蛋白序列. 使用以上序列和金钗石斛DnMSI1-like 蛋白序列进行比对并构建了以酵母(NP_010858.3)的MSIL 同源蛋白为外类群的系统进化树(图2). 经分析，植物MSIL 蛋白聚为3大分枝，一枝以拟南芥的AtMSI1 为代表，一枝以拟南芥AtMSI2/3 为代表，而还有一枝则包含了拟南芥的AtMSI4/5.MSI2/3 分枝再次分枝为MSI2 和MSI3两枝，而MSI4/5 则再分枝为MSI4 和MSI5 两枝.MSI1 分枝包含了来自被子植物、裸子植物和藓类、藻类的同源蛋白，表明该分枝的祖先基因远在单细胞藻类出现以前可能已经存在.DnMSI1-like 与被子植物谱系的基部物种无油樟的MSIL 蛋白(XP_006836428.1)较为接近，聚在单子叶和双子叶植物之外;在双子叶植物中，DnMSI1-like 与洛基山耧斗菜的MSI1 蛋白(AEZ06402.1)距离较近，且与大多数双子叶物种的MSI1 蛋白距离比与单子叶物种的同源蛋白距离较近.

图2 DnMSI1-like 蛋白的系统发育Figure 2 Phylogenetic analyses for DnMSI1-like protein

2.3 DnMSI1-like 表达的组织特异性

利用半定量RT-PCR 检测结果表明，DnMSI1-like 在金钗石斛的根、花和腋芽中均有表达，而在茎、叶和愈伤组织中没有检测到表达产物(图3A).本研究同时收集了另外一批样品进行了荧光定量PCR 验证. 结果表明，以DnUBQ 基因为内标时，DnMSI1-like 在根和花中的表达水平比腋芽高，分别可达到腋芽中表达量的40.6 和95.7 倍，而在茎、叶中的表达则比腋芽低2 ～4 倍(图3B).

图3 DnMSI1-like 基因表达的组织特异性Figure 3 The tissue-specific expression of DnSMI1-like gene

2.4 低温诱导DnMSI1-like 的表达变化

在生产实践中，金钗石斛在昼夜温度16 ℃/10 ℃处理40 d 促进提前开花. 本研究发现不同处理时间的腋芽样品，DnMSI1-like 在花芽中表达变化.结果显示:在低温处理5 d 后，DnMSI1-like 的表达急剧上调，达到了低温处理前的71 倍;当处理时间延长直至30 d，其表达仍一直保持较为平稳的高水平(图4)，表明DnMSI1-like 基因可响应低温.

图4 低温处理时间对DnMSI1-like 在侧芽中相对表达量的影响Figure 4 Effect of expression of DnMSI1-like in response to prolonged low-temperature in aillary buds of D.nobile

3 讨论

MSIL 蛋白是一类含有串联的WD40 结构域的、在真核生物中普遍存在和保守的蛋白质. 2005年Hennig 对有限的MSIL 同源蛋白的分析表明，被子植物中的MSIL 蛋白可分为3 类，分别以拟南芥的AtMSI1、AtMSI2/3 和AtMSI4/5 为代表［1］.本研究扩大了同源蛋白的数量，并包括了最近完成了基因组测序的被子植物基部物种无油樟的MSIL 蛋白，以果蝇MSIL 蛋白为外类群构建的部分的被子植物MSIL 蛋白进化树，所得结果与Hennig［1］的类似. 通过进一步的分析，推测MSIL 基因在被子植物中的扩张可能来自于2个祖先基因拷贝，在被子植物出现前，这些祖先基因甚至可能已经存在.在被子植物中，其中一个拷贝进化为MSI4/5 类;而另一个拷贝则经过了1 次复制事件后进化为MSI 2/3 类和MSI1 2 类的祖先基因. 在MSI 4/5 分枝和MSI 2/3分枝中可能各自再经历过至少1 次的复制后使得MSIL 蛋白基因的拷贝数增加为至少5个. 总之，MSIL 基因家族在被子植物中的进化经历了至少2次的复制事件.但是，由于植物物种的基因组信息的缺乏，无法准确判断各个复制事件发生的具体时间.且这些推断可能存在偏差，未来新的数据的加入将会有助于更准确地了解MSIL 基因家族的扩张和进化.

本研究从金钗石斛中克隆获得的MSIL 基因的cDNA 序列，推测编码拟南芥的MSI1 蛋白的同源蛋白DnMSI1-like.同源性和系统发育分析表明，DnMSI1-like 与被子植物基部物种无油樟以及多数被分析的双子叶植物的MSIL 蛋白的遗传距离较为接近，而与被分析的单子叶植物的距离相对较远，这与我们对其它金钗石斛基因的进化分析的结果一致(未发表).

本研究检测表明，DnMSI1-like 基因在根、叶、花、花芽、假鳞茎和愈伤组织中均有表达，以花芽和花中表达较强，与Köhler［3］和Hennig［1］报道的拟南芥同源基因相似. 另一方面，DnMSI1-like 在根部的表达较茎、叶高. DnMSI1-like 在这些组织中的高表达是否意味着它参与这些器官的发育，需要进一步研究.

人工春化处理的金钗石斛开花提前.当人工春化处理(昼夜温度16 ℃/10 ℃处理)时，在花芽中DnMSI1-like 基因表达在短时间内急剧上调，表明该基因编码的蛋白可能强烈地响应低温刺激，为进一步研究DnMSI1-like 基因与春化作用的相互联系提供了线索.此外，最近研究表明拟南芥AtMSI1 通过光周期途径调控开花［16］，研究DnMSI1-like 与光周期途径的相互关系将有助于解释金钗石斛开花的调控机制.

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