骨肉瘤DCE-MRI和瘤组织内乏氧及血管生成相关研究

甄俊平，卫小春，王晨，李立志，胥毅，杨宇，樊鹏，聂晓

1.山西医科大学第二医院影像科，太原 030001

2.山西医科大学第二医院骨科，太原030001

3.山西医科大学第二医院病理科，太原 030001

肿瘤的血管生成是指从已存在的血管形成新生毛细血管的过程[1]，对实体肿瘤的发生及发展起关键作用。动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI，DCE-MRI)提供了探索对比剂渗透到肿瘤间质的一种无创手段。研究表明骨肉瘤组织中也存在着组织乏氧现象和血管形成，组织乏氧因子(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)、微血管密度(microvessel density，MVD)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)表达水平与骨肉瘤组织细胞生长、侵袭及转移能力增强相关[1-2]，探讨DCE-MRI能否对评价骨肉瘤内血管生成情况及乏氧提供可靠、稳定、无创的影像方法，进而为临床的个性化治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集自2011年9月至2014年9月在山西医科大学第二医院骨科就诊并经病理穿刺证实的骨肉瘤患者。检查前未做过任何放、化疗，无肺及远处转移，所有检查均征得患者或家属的知情同意，男18例，女12例。股骨远端16例，胫骨近端7例，腓骨近端2例，肱骨近端3例，骨盆2例。

1.2 感兴趣部位的选择和标记

选取动态增强MRI图像后某一部位感兴趣区(region of interest，ROI)，将来标记后，CT引导下穿刺活检，使两者保持高度一致。

1.3 磁共振平扫及动态增强扫描

采用GE公司HD3.0 T磁共振扫描仪，使用体部线圈，患者采取仰卧位。平扫选取横轴位、矢状位及冠状位扫描序列包括SE-T1WI、FSET2WI、脂肪抑制序列扫描；冠状位扫描序列TR为1700 ms，TE为70 ms。经肘静脉快速团注按0.1 mmol/kg体重计算的钆双胺量，并紧随20 ml的生理盐水。增强扫描采用冠状位，三维快速扰相位梯度回波T1WI多时相成像，共30个时相(600 s)；并最后扫描横轴位，FSPGRT1WI序列，参数如下：TR=1700 ms，TE=70 ms，Nex=2，Flip angle=45°。

1.4 动态增强参数的获取和分析

由两位10年以上工作经验的MRI专业诊断医师诊断和测量，采用GE FuncTool软件处理图像，采用双盲法对动态增强MRI图像后处理，获得感兴趣区时间-信号强度曲线,通过测量得到以下参数：最大强化率(SImax)、对比剂到达肿瘤组织时间(time at arrival of contrast infl ow，T1 onset)、达峰时间(Tpeak TP)、强化曲线平均斜率(slope)以及最大线性斜率(maximum slope Smax)。

1.5 HIF-1α、CD34和VEGF表达用MaxVision免疫组化二步法测定和MVD计数

骨肉瘤标本经10%的福尔马林固定，石蜡包埋、切片，作HE、酶及免疫组化染色。石蜡切片脱蜡至水。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，将切片置于高压锅内进行抗原修复，3%的H2O2室温孵育8 min，PBS冲洗，2 min×3次。用HIF-1α多克隆抗体(Thermo公司生产)、鼠抗人CD34单克隆抗体(江苏普罗赛生物技术有限公司)及抗VEGF单克隆抗体(江苏普罗赛生物技术有限公司)作为一抗进行染色，用DAS显色[3]。

结果判定：在高倍镜下(×400)随机选取4个视野，根据许良中方法[3]，将染色强度及阳性细胞的按百分率分别计数，染色强度与背景着色相对比：无染色为0分、棕黄色为1分、中等棕黄色为2分、深棕黄色为3分。阳性细胞的百分率：无阳性细胞为0分、≤10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分，＞75%为4分。两项指标的乘积＞3分为免疫反应阳性，两项计分相乘为最后结果。

低倍镜下先寻找CD34明显染色区(肿瘤血管的热点区)，后于高倍镜下计数染色血管数量，采用Foote等[4]方法测量单位面积上的血管数目，取3 个视野内的微血管数目，采用Weidner法进行MVD计数并计算其平均MVD值。

1.6 统计学方法分析

应用统计分析软件，版本SPSS 16.0，检验水准α=0.05，采用Spearman相关性检验。

2 结果

骨肉瘤患者MR平扫图像见图1～4；穿刺活检部位组织学及免疫组化染色结果见图5～8；增强后兴趣区获得时间-信号强度曲线见图9、10；测量动态增强的诸参数分别与HIF-1α表达、CD34计数及VEGF的表达做Spearman相关性检验。

HIF-1α、MVD与VEGF 3个指标间是正相关关系,HIF-1α与VEGF有明显相关性(P＜0.001)。半定量参数中：T1 onset、TP和HIF-1α、MVD与VEGF表达呈负相关关系，slope、Smax、SImax与HIF-1α、MVD与VEGF 3个指标间呈正相关关系(表1、2)。

3 讨论

图1 、2 矢状位T1WI显示胫骨中上段等低混杂信号，可见骨皮质破坏和骨膜反应，T2WI可见囊泡状信号 图3、4 冠状位及横轴位T2压脂序列，可见骺板有局部受侵，周围可见软组织肿块图5 大体标本瘤细胞异型性明显，可见多核瘤巨细胞，病理核分裂易见，大量瘤性成骨 图6 免疫组化结果 CD34（血管+)，穿刺病理标本的MVD 图7、8 分别为穿刺病理标本的血管内皮生长因子及乏氧诱导因子-1的表达 图9 感兴趣的选择，兴趣区1为骨肉瘤组织，兴趣区2为正常骨组织 图10 骨肉瘤时间-信号强度曲线和斜率、强度图Fig.1 ,2 The sagittal T1WI shows low-mixed signals on the upper tibia.Visible cortical bone destruction and periosteal reaction also can be found.T2WI shows visible vesicle-like signal.Fig.3,4 Coronal and axial T2 fat pressure sequence,the epiphyseal plate has been localy involved,the tumor has been surrounded by the soft tissue.Fig.5 The specimens.The tumor cell atypia,multinucleated giant cell tumor,and the pathological mitotic,is easy to see.Also,a lot of neoplastic bone formation.Fig.6 Immunohistochemistry CD34(vascular +)and MVD of biopsy specimen can be seen as well.Fig.7 Biopsy specimens of vascular endothelial growth factor.Fig.8 Hypoxia inducible factor-1 expression.Fig.9 Shows interesting options,interest area 1 is the osteosarcoma tissue,interest area 2 is the normal bone tissue.Fig.10 Time-signal intensity curve.

表1 MR动态参数与HIF-1α、MVD及VEGF表达的相关性Tab.1 The correlations beween MR dynamic parameters and HIF-1α,MVD and VEGF expression

表2 HIF-1α、MVD与VEGF三者表达的相关性Tab.2 Correlations between HIF-1α,MVD and VEGF expression

3.1 肿瘤动态增强MRI

MRI多方位、多序列成像，高分辨成像能对肿瘤，特别是骨肉瘤的脉管系统提供更好的形态学的显示，随着时间分辨力的提高，可以实现对肿瘤增强扫描的动态现象，提供肿瘤微循环的灌注信息，为个性化治疗提供科学指导和依据。Mayr等[5]通过研究发现：应用动态增强磁共振成像来判断宫颈癌的放射敏感性及使用逐象素的动态对比度增强分析长期肿瘤控制的预后，确定肿瘤微循环的异质性。该研究对16例晚期宫颈癌检查与动态对比增强磁共振成像在放射治疗的过程中进行逐个像素的统计后比率，以在肿瘤区域扫相对信号强度(RSI)值的分析来生成的动态增强图案的像素的RSI分布。初步研究结果表明，在肿瘤内差的血管区域，动态增强扫描的定量可能在预测长期肿瘤控制和治疗，对宫颈癌治疗有指导意义。Gong等[6]研究7例宫颈癌36次MRI检查，前瞻性研究调查了放射治疗时宫颈癌的MRI动态增强与宫颈癌改变之间的关系，并在整个放疗监测肿瘤消退率。结果发现，峰和平均增强参数放射治疗前介于3.0至13.3和1.9至12.2，经2周放疗，峰和增强后意味着增强介于7.5至13.0和6.3至10.6。在峰值和平均动态扫描之间肿瘤增强的变化范围分别从－2.0至8.4和－4.5至8.5。肿瘤体积随时间(P＜0.01)呈指数衰减。肿瘤消退率从2.0%至每天15.2%，并且与两个峰的变化相关，且平均肿瘤增强(P＜0.01)。可以得出结论，MR监测第2周放疗的动态增强可能提供早期的肿瘤消退率预测，因此DCE-MRI是宫颈癌治疗方案的有效检测手段。Hye Suk Hong[7]指出最大上升斜率MSI与直肠癌的N分期表现出显著相关性，能够提供有用的预后信息(化疗之后又一种疗效确切的治疗方案)。

3.2 实体肿瘤乏氧及血管形成相关性

肿瘤血管生成的重要刺激是缺氧，缺氧诱导基因转录以此改变细胞代谢，并且促进血管生成。组织乏氧诱导HIF-1形成，HIF-1是由α亚基和β亚基(HIF-1α和HIF-1β)的结合形成的异二聚体，在正常氧供条件下，HIF-1β经常在哺乳动物细胞中表达，但是HIF-1α仍未被发现。而在乏氧时，HIF-1α可以被表达。而且HIF-1α阳性细胞在肿瘤坏死周围和微血管密度较高的区域非常密集，以肿瘤浸润边缘最多。研究表明乏氧导致的VEGF高表达是由HIF-1α诱导的，高的VEGF表达使组织内微血管密度增加，导致肿瘤生长以及与局部转移直接相关，而与生存率没有正相关性，乏氧改变了细胞代谢并且促进细胞生长、结构改变、提高血管渗透性，使癌细胞易于进入血循环，多种机制可能导致了其发生发展，包括无抑制的的生长、肿瘤细胞增加的氧耗、淋巴引流不畅导致间质高压、血管破坏和低PH以及瘤内由不成熟血管引流的富氧血流。此外，肿瘤血管生成未必等同于肿瘤血供，不成熟新生血管的基底膜允许血浆和蛋白外渗透，进一步增加间质瘤内压力的外渗，血管持续崩溃，以及营养输送的缺乏[7-14]。

3.3 骨肉瘤的DCE-MRI与乏氧及血管生成

骨肉瘤主要病理改变主要有：瘤骨形成、骨膜反应和软组织肿块，其中肉瘤部分对血管依赖性强[15]。将DCE-MRI的手段运用到骨和软组织肿瘤的术后随访中，对于区分肿瘤术后复发、新发肿瘤结节、鉴别炎症及反应性改变将起到不可替代的作用。对术后及放化疗后复发的肿瘤，该手段能够较为迅速且准确地检查出来[13]。近年来，相关的研究成果表明：MVD与肿瘤的恶性程度、与周围组织浸润程度、术后复发以及预后关系密切。MVD已成为判断肿瘤复发、转移和疗效的重要指标。而目前抗血管生成治疗也己成为继手术切除、放射治疗的又一新的治疗方法。如果化疗能有效抑制骨肉瘤生长，细胞毒性药物必须达到对所有的肿瘤细胞作用的有效剂量。虽然许多临床试验包括在血液或脑脊液这些药物的药代动力学研究中，至今仍没有确定的化疗药是否到达实体瘤的所有区域。Reddick等[16]讨论了使用DCEMRI来评估骨肉瘤的微循环和间质。DCE-MRI提供了探索对比剂泄漏到肿瘤间质的手段。在对众多骨肉瘤的临床观察中，对比增强方法及增强后相关参数的测量，可以测量和预测骨肉瘤对术前化疗的反应敏感性。

本研究结果表明,MR动态增强扫描可反映骨肉瘤肿瘤组织乏氧与血管生成情况。由于骨肉瘤具有肿瘤异质性特点，本研究并未对比研究实体瘤外周区域及中心区域DCE-MRI半定量参数及HIF-1α、MVD及VEGF表达的差异。

[References]

[1]Graham CH,Forsdike J,Fitzgerald CJ,et al.Hypoxia-mediated stimulation of carcinoma cell invasiveness via upregulation of urokinase receptor expression.Int J Cancer,1999,80(4):617-623.

[2]Stadler P,Becker A,Feldmann HJ,et al.Influence of the Hypoxic subvolume on the survival of patients with head and neck cancer.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1999,44(4):749-754.

[3]Liang JH,Li JG.Dynamic enhanced MRI for nasopharyngeal carcinoma tissue hypoxia and angiogenesis detection research.The Practical Journal of Cancer,2010,25(4):350-353.梁璟慧,李金高.动态增强MRI对鼻咽癌组织内乏氧和血管生成检测的研究.实用癌症杂志,2010,25(4):350-353.

[4]Foote RL,Weidner N,Harris J,et al.Evaluation of tumor angiogenesis measured with microvessel density(MVD)as a Prognostic Indicator in nasopharyngealcarcinoma results of RTOG 9505.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,61(3):745-753.

[5]Mayr NA,Yuh WT,Arnholt JC,et al.Pixel analysis of MR Perfusion imaging in predictin gradiation therapy outcome in Cervical cancer.Magn Reson Imaging,2000,12(6):1027-1033.

[6]Gong QY,Brunt JN,Romaniuk CS,et al.Contrast enhanced Dynamic MRI of cervical carcinoma during radiotherpy:Early prediction of tumour regression rate.Br J Radiol,1999,72(864):1177-1184.

[7]Hong HS,Kim SH,Park HJ,et al.Correlations of dynamic contrast.Enhanced magnetic resonance imaging with morphologic,angiogenic,and molecular prognostic factors in rectal cancer.Yonsei medical journal,2013,54(1):123-130.

[8]Semenza GL.Intra tumo ralhypoxia,radiation resistance,and HIF-1.Cancer Cell,2004,5(5):405-406.

[9]Quintero M,Mackenzie N,Brennan PA.Hypoxia-inducible factor1(HIF-1)in cancer.Eur J Surg Oncol,2004,30(5):465-468.

[10]Moeller BJ,Cao Y,Li CY,et al.Radiation activates HIF-1 To regulate vascular radio sensitivity intumors:role of reoxygenation,free radicals,and stress granules.Cancer Cell,2004,5(5):429-441.

[11]Duffy JP,Eibl G,Reber HA,et al.Influence of hypoxia and neoangiogenesis on the growth of pancreatic cancer.Mol Cancer,2003,22(2):12.

[12]Li M,Jin Z,Li GJ,et al.Correlation between angiogenesis and multiparameters of Dynamic contrast-enhanced for assessments of benign and malignant breast lesions.Chin J Magn Reson Imaging,2010,1(1):36-42.李敏,金真,李功杰,等.乳腺动态增强MRI参数与肿瘤血管的相关性及其鉴别诊断价值.磁共振成像,2010,1(1):36-42.

[13]Padhani AR,Hayes C,Assersohn L,et a1.Prediction of clinic pathologic response of breast cancer to primary chemotherapy at contrast-enhanced MR imaging：initial clinical results.Radiology—Radiological Society of North America,2006,239(2):361-374.

[14]Lu RZ,Zhang JC,Yang ZH,et al.The value of dynamic contrastenhanced MRI in assessing the early-term effectiveness of highintensity focused ultrasound ablation of hysteromyoma.Chin J Magn Reson Imaging,2013,4(4):39-43.卢瑞沾,张俊成,杨振华,等.DCE-MRI对评价高强度聚焦超声刀治疗子宫肌瘤早期疗效的价值.磁共振成像,2013,4(4):271-275.

[15]Chen HS,Han Y,Geng Q,et al.The differential diagnosis between benign and malignant bone tumors.Chin J Magn Reson Imaging,2014,5(4):291-293.陈海松,韩燕,耿青,等.良恶性骨肿瘤的MRI鉴别诊断.磁共振成像,2014,5(4):291-293.

[16]Reddick WE,Taylor JS,Fletcher BD.Dynamic MR imaging(DCEMRI)of microcirculation in bone sarcoma.J Magn Reson Imaging,1999,10(3):277-285.