丹参酮联合氧化苦参碱干预银屑病模型的实验研究

王东英 彭 巍刘 剑 胡 成 陈意蕾

·论著·

丹参酮联合氧化苦参碱干预银屑病模型的实验研究

王东英 彭 巍∗刘 剑 胡 成 陈意蕾

目的: 明确丹参酮联合氧化苦参碱对银屑病模型细胞增殖、颗粒层形成及小鼠阴道上皮有丝分裂的影响。方法: 体外培养HaCaT细胞、构建小鼠尾鳞片形成模型和小鼠阴道上皮细胞过度增殖模型，构建成功后分别分组给予丹参酮、氧化苦参碱及丹参酮与氧化苦参碱联合的处理。结果: 丹参酮，氧化苦参碱及联合用药对HaCaT细胞的增殖均具有浓度依赖性抑制作用且丹参酮和氧化苦参碱对HaCaT细胞增殖的抑制作用具有协同效应；丹参酮、氧化苦参碱及联合用药均可促进小鼠尾部皮肤颗粒层的形成，可抑制小鼠阴道上皮有丝分裂，联合用药组作用最强。结论: 丹参酮和氧化苦参碱联合应用具有抑制HaCaT细胞增殖和阴道上皮细胞分裂，促进颗粒层形成的作用。

丹参酮； 氧化苦参碱； 银屑病

HaCaT细胞是正常突变的永生化人角质形成细胞株，是目前研究银屑病最常用的细胞模型之一。HaCaT细胞的生物学特性与原代培养的角质形成细胞类似，但操作更为简单。1鼠尾鳞片表皮天然缺乏颗粒层而呈现出角化不全的特征，可模拟银屑病角化不全的特点，利用此模型可评价药物促进颗粒层形成的作用。小鼠阴道上皮细胞可因雌激素刺激而发生周期性增殖活跃、上皮细胞转换加快等变化，若药物能抑制细胞过度增生，则认为该受试物对有丝分裂有抑制作用，可用于银屑病的治疗。这两种模型与诱发性模型、转基因动物模型、异体移植模型等相比操作简单，实验周期短，是国内研究银屑病治疗药物最常用的动物模型。2

丹参酮(Tanshinone)亦称总丹参酮，是从中药丹参提取的一类脂溶性菲醌化合物，具有抗菌、消炎、活血化瘀、促进伤口愈合等多方面作用。商干伟等3，4研究发现丹参酮对斑块型和点滴型银屑病有较好的治疗效果，王均5研究发现丹参酮治疗寻常型银屑病的临床疗效高且无明显不良反应。氧化苦参碱(Oxymatrine，OMT)系豆科槐属植物苦参等所含生物碱，具有抗炎、抗过敏、免疫调节作用。研究表明该药具有抑制细胞有丝分裂和促进颗粒层形成作用，所以应用在银屑病治疗中可以抑制表皮细胞增生过快和促进表皮颗粒层形成。6

目前国内外尚无丹参酮与氧化苦参碱联合治疗银屑病的报道，但丹参和苦参在许多治疗银屑病的中药制剂如克银方、凉血消银汤等之中较为常见。7，8本课题旨在观察丹参酮与氧化苦参碱联合应用对实验性银屑病模型的作用并探讨其作用机制。

1 材料

ICR小鼠，18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号:0186652，0208265。饲养条件:室温22.28±0.71℃，湿度(53.43±3.69)%；光照明暗12 h/12 h。饲料购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。生产许可证号:SCXK(军) 2007－0005。饮用水为自来水过滤，自由饮用。人永生角质形成细胞(HaCaT)购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。复方地蒽酚软膏(20 g/支，地蒽酚1%，水杨酸3%，批号140220)购自武汉中联集团四药药业有限公司。丹参酮软膏(2%)、氧化苦参碱软膏(4%)及复方丹参酮氧化苦参碱软膏(丹参酮2%，氧化苦参碱4%)由本院药剂科配制，批号:T20140303、O20140303、C20140303。封闭式全自动组织脱水机(ASP300，Leica，德国)；分体式组织包埋机(EG1140，Leica，德国)；半自动轮转式切片机(RM2145，Leica，德国)；倒置荧光显微镜(IX71，Olympus，日本)。

2 方法

2.1 HaCaT细胞增殖实验 HaCaT细胞以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液常规培养，调整细胞密度为1×105个/mL接种于96孔板中，每孔200 μL，37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后给药。丹参浓度2、4、8、16、32、64 μg/mL、氧化苦参碱浓度4、8、16、32、64、128 μg/mL、联合用药组浓度2.5、5、10、20、40、 80 μg/mL(其中丹参酮与氧化苦参碱质量比为1∶2)，另设空白对照组。给药后继续孵育24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h后每孔加入二甲亚砜150 μL，酶标仪490 nm测量各孔的吸光度值。每浓度设置2个复孔，平行测定3次取平均值。计算增殖抑制率及IC50，联合用药组求得IC50后，计算其中丹参酮与氧化苦参碱含量，采用等效应曲线图观察丹参酮和氧化苦参碱是否具有协同效应。

2.2 小鼠尾鳞片颗粒层形成实验 ICR小鼠50只，按体重随机分为5组。模型对照组尾部涂抹凡士林，阳性对照涂抹复方地蒽酚软膏，给药组分别给予丹参酮软膏、氧化苦参碱软膏及复方丹参酮氧化苦参碱软膏。沿小鼠背侧尾根2～4 cm处涂药，50 mg/次·d，连续给药7 d。末次给药24 h后CO2麻醉处死小鼠，取给药处皮肤，10%甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，切厚约5 μm片，苏木素－伊红(HE)染色。光学显微镜观察鼠尾部皮肤角化层、颗粒层等变化，计数各实验组尾鳞片中有颗粒层形成的鳞片数。

2.3 小鼠阴道上皮增殖实验 ICR小鼠60只，按体重随机分为6组，除空白对照组外，其余各组均腹腔注射己烯雌酚0.2 mg/只，每日给药1次，给药3 d构建小鼠阴道上皮有丝分裂模型。固定模型小鼠，取预先吸有药物的钝性管，小心插入阴道2～3 mm，灌注相应剂量的药物，动作要轻柔，不能对阴道黏膜造成机械损伤。空白对照组不给药，模型对照组给予凡士林，阳性对照给予复方地蒽酚软膏，给药组分别给予丹参酮软膏、氧化苦参碱软膏及复方丹参酮氧化苦参碱软膏。每日给药1次，给药7 d，末次给药1 h后，各组小鼠腹腔注射秋水仙碱2 mg/kg，使细胞有丝分裂停滞于有丝分裂中期。注射秋水仙碱4 h后麻醉处死动物。取阴道10%中性甲醛固定，脱水，石蜡包埋，每个标本切片2张，1张进行HE染色，观察有丝分裂情况并计算有丝分裂指数(每100个基底细胞有丝分裂数)。另一张进行免疫组化染色，观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的阳性表达率。阳性物质呈棕黄色颗粒状，主要位于细胞核，偶见胞浆。每张切片随机取5个高倍视野，每组观察50个高倍视野。每个视野观察2个指标:以标准＜20%为1；20%～50%为2；＞50%为3，反应阳性反应细胞的比例；以在阳性反应细胞中多数细胞核浅着色为1；多数深着色边界清楚为2。以上两项相加等于2为(＋)；等于3为(＋＋)；≥4为(＋＋＋)，阳性反应着色深度。9

2.4 统计学分析 数据采用SPSS 17.0进行统计分析，计量数据采用¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，记数数据组间比较采用秩和检验，P＜0.05为有显著性差异。

3 结果

3.1 丹参酮联合氧化苦参碱对HaCaT细胞增殖的影响 丹参酮2～64 μg/mL，氧化苦参碱4～128 μg/mL及联合用药2.5～80 μg/mL对HaCaT细胞的增殖均具有浓度依赖性抑制作用，其IC50(95%置信区间)分别为47.2(36.0～69.3)μg/mL，124.4(84.3～314.3) μg/mL，24.2(7.1～43.1)μg/mL。其中联合用药组中丹参酮和氧化苦参碱含量分别为8.1(2.4～14.4)μg/ mL，16.1(4.7～28.7)μg/mL。等效应曲线显示，丹参酮和氧化苦参碱在所设计浓度范围内对HaCaT细胞增殖的抑制作用具有协同效应，见图1。

图1 等效应曲线图

以丹参酮的IC50(95%置信区间)为横轴，氧化苦参碱的IC50(95%置信区间)为纵轴作图，连接两坐标轴上相对应的点即为等效应曲线，联合用药组IC50(95%置信区间)以其中丹参酮的含量为横坐标，氧化苦参碱的含量为纵坐标，确定其在等效应曲线图上所处位置，如图所示处于等效应曲线下方，即丹参酮和氧化苦参碱具有协同作用。

3.2 丹参酮联合氧化苦参碱对小鼠尾鳞片颗粒层形成的影响 空白对照组表皮偶见个别鳞片有颗粒层形成，阳性对照组鳞片颗粒层形成明显增多。给药组表皮可见较多有颗粒层形成的鳞片，见表1，图2。

3.3 丹参酮联合氧化苦参碱对小鼠阴道上皮增殖的影响 空白对照组小鼠阴道上皮正常，可见少量有丝分裂细胞，PCNA阳性率低。与空白对照组相比，模型对照组小鼠阴道上皮角化层明显，有丝分裂指数显著增高(P＜0.01)，PCNA阳性率明显增高(P＜0.01)。给药各组均可抑制小鼠阴道上皮有丝分裂及PCNA的表达(P＜0.05，P＜0.01)且复方丹参酮氧化苦参碱软膏组效果优于丹参酮软膏组和氧化苦参碱软膏组，见表2，图3。

表1 各组对小鼠尾部鳞片颗粒层的影响

图2 各组对小鼠尾鳞片颗粒层形成的影响(HE，×200)

表2 各组对小鼠阴道上皮有丝分裂的影响

图3 各组对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响(HE，×200)

4 讨论

银屑病是一种以表皮过度增殖、真皮慢性炎症、角化不全为主要特征的易发性炎性皮肤病，具有病程长、顽固难愈和复发率高等特点，严重影响患者的身心健康及生活质量。10银屑病发病机制复杂，单一药物的局部应用往往难以达到较好的治疗效果，因此在实际治疗中常联合用药，在不明显增加副作用的同时可达到较好的治疗效果。11研究表明免疫系统参与银屑病的发生和发展，免疫因子激活T细胞释放白介素、细胞因子、干扰素等细胞因子，诱导棘层细胞增厚，表皮细胞过度增殖。10因此抑制表皮细胞的异常增生是治疗银屑病的关键。

中医将银屑病分为血燥型、血淤型等。认为治疗宜采用滋阴润燥、养血化淤、解毒退疹的治疗原则。丹参具有活血化瘀改善皮肤血液循环的作用，苦参则有祛风润肤止痒等作用，因此丹参和苦参常是治疗银屑病的中药之一。除在多味药材的复方中共同使用，单纯苦参和丹参制剂复合应用亦有许多研究，李国军等12采用苦参素联合丹参注射液治疗慢性乙型肝炎，取得了良好的效果。丹参酮和氧化苦参碱单独应用对于银屑病模型及患者均具有良好疗效，施惠娟等13发现氧化苦参碱可抑制雌激素周期小鼠阴道上皮细胞的增殖，该作用可能与其降低表皮细胞PCNA表达水平，促进表皮细胞凋亡有关。张玉杰等14观察了丹参酮胶囊对进展进期银屑病的疗效，认为丹参酮胶囊是一种疗效优越、安全性高的银屑病治疗药物。以上研究为丹参酮和氧化苦参碱联合应用于银屑病的治疗提供了理论基础。

本研究采用HaCaT细胞增殖模型、小鼠尾鳞片模型和小鼠阴道上皮细胞模型，比较了丹参酮、氧化苦参碱及两者联合应用对以上3种模型的影响，结果显示，丹参酮和氧化苦参碱单独应用均可抑制HaCaT细胞增殖，促进小鼠尾部皮肤颗粒层形成，抑制己烯雌酚引起的小鼠阴道上皮细胞异常增殖，而复方丹参酮氧化苦参碱组对3种模型的作用均优于丹参酮和氧化苦参碱单独应用，且在HaCaT细胞增殖模型上，二者联合应用呈现明显的协同作用，证明丹参酮和氧化苦参碱联合应用于银屑病治疗具有较好的效果，值得进一步研究。

1陶春蓉，黄国军，艾儒棣，等.白疕方及其组成药物提取液对HaCaT细胞增殖的影响.中国中医急症，2012，21(2):230－231.

2袁媛，朱键平，陈系古.银屑病动物模型.中国实验动物学报，2008，16(1):70－73.

3商干伟，朱蓉，王秀芬，等.丹参酮治疗斑块型银屑病的疗效观察.实用临床医药杂志，2009，13(11):68－69.

4商干伟，孙洪林，周书祥，等.丹参酮治疗点滴型银屑病68例的疗效观察.皮肤病与性病，2006，28(4):13－15.

5王均.丹参酮胶囊治疗寻常型银屑病患者的临床疗效观察.医

药临床研究，2012，29(1):177－178.

6郑小景.窄谱中波紫外线联合苦参素胶囊治疗寻常型银屑病疗效观察.医药前沿，2013，20:213.

7刘靖，查旭山.凉血消银汤治疗进行期寻常型银屑病(血热证)32例疗效观察.新中医，2006，38(8):28－29.

8章光华，唐兴荣.中医分阶段辨证治疗银屑病关节炎58例疗效观察.新中医，2006，38(6):34－35.

9闫铁夫.黄芪注射液联合阿维A对小鼠银屑病模型的影响.重庆医科大学学报，2013，38(1):58－60.

10黄桂新.银屑病病因与发病机制的研究进展.中国医药指南，2012，10(13):73－74.

11中华医学会皮肤性病学分会银屑病学组.中国银屑病治疗指南(2008版).中国实用乡村医生杂志，2014，2:2－4.

12李国军，郭西萍.苦参素联合丹参注射液治疗慢性乙型肝炎疗效观察.中国中西医结合消化杂志，2002，10(4):240－241.

13施惠娟，周茹，金少举，等.氧化苦参碱对银屑病模型雌激素周期小鼠阴道上皮细胞增殖和凋亡的影响.临床皮肤科杂志，2011，40(11):669－672.

14张玉杰，王庆玲.丹参酮胶囊治疗进展期银屑病疗效观察.中国临床药理学与治疗学，2001，6(4):366－367.

(收稿:2014－08－20)

The effects of Tanshinone combined with Oxymatrine on the psoriasis model

WANG Dong-ying，PENG Wei，LIU Jian，et al.The 92nd Hospital of PLA，Fujian，353000

Objective:To determine the effects of Tanshinone combined with Oxymatrine on the proliferation of HaCaT cells，stratum granulosum formation and mitosis of mouse vaginal epithelia.Methods:HaCaT cells were cultured in vitro and the tail scale formation mouse model and vaginal epithelial cells excessive proliferation mouse model were constructed.The HaCaT cells and the mice in the two models were treated with Tanshinone，Oxymatrine and Tanshinone combined with Oxymatrine.Results:The proliferation of HaCaT cells was inhibited after treated with Tanshinone，Oxymatrine and Tanshinone combined with Oxymatrine in a concentration－dependent manner.Oxymatrine and Tanshinone cooperated mutually in the process of inhibiting the proliferation of HaCaT cells.The granular cells in the flake of the mouse’s tail were increased and the mitosis of mouse vaginal epithelia was inhibited after treated with Tanshinone，Oxymatrine and Tanshinone combined with Oxymatrine.Conclusion:Tanshinone combined with Oxymatrine inhibite the HaCaT cells proliferation and mitosis of mouse vaginal epithelia and promote the formation of stratum granulosum.

Tanshinone；Oxymatrine；psoriasis

中国人民解放军第九二医院，福建南平，353000

∗通信作者