诱导性多能干细胞在神经系统变性疾病中的研究与应用

董健健(综述)，程 楠,韩咏竹(审校)

(1.安徽中医药大学研究生部,合肥 230038；2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院神经内科，合肥 230061)



诱导性多能干细胞在神经系统变性疾病中的研究与应用

董健健1,2△(综述)，程 楠2※,韩咏竹2(审校)

(1.安徽中医药大学研究生部,合肥 230038；2.安徽中医药大学神经病学研究所附属医院神经内科，合肥 230061)

神经系统变性疾病为一类缓慢起病、病程呈进行性发展、预后不良的疾病。近年来，神经变性疾病的发病率逐步上升。但是, 临床上对于该类疾病还没有十分有效的治疗方法，其发机制也未完全清楚。随着体细胞重编程技术的进步，疾病特异性诱导性多能干细胞被逐渐应用于神经变性疾病发病机制、药物筛选及临床治疗方法的研究。然而，体细胞重编程技术尚处于早期级阶段，诱导性多能干细胞存在潜在的致癌风险及产生效率较低等问题，未来研究人员将致力于建立安全、高效、符合临床标准的诱导性多能干细胞。

神经变性疾病；诱导性多能干细胞；体细胞重编程；细胞模型

神经系统变性疾病是以神经元细胞进行性变性、坏死为共同病理特点，主要累及中枢神经系统的一大类慢性进行性神经系统疾病。该类疾病发病率高，多数病因不明且缺乏有效的治疗方法，对其病因病机和有效治疗方法的研究一直没有停止[1]。近年来，随着诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)技术的出现，因其在神经系统变性疾病的研究(尤其是治疗学研究)中具有诱人的应用前景而备受关注[2]。iPSC是利用反转录病毒、腺病毒等载体，将某些特殊的转录因子导入终末分化的成体细胞，重编程诱导成具有潜在分化功能的干细胞。2006年，Takahashi和Yamanaka[3]将成鼠的成纤维细胞重编程成iPSC，它具有与小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)十分相似的生理特性。2007年，iPSC技术在人类体细胞中得以应用[4]。2009年，Ebert等[5]建立了人脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)iPSC模型并应用于SMA的发病机制和治疗学研究。现对近年来iPSC在神经变性疾病中的研究和应用加以综述。

1 iPSC在神经变性疾病发病机制中的研究与应用

1.1 帕金森病(Parkinson′s disease, PD) PD又名震颤麻痹，是最常见的神经变性性疾病之一，以中脑黑质致密部、蓝斑神经元色素脱失，黑质色素变淡及出现路易小体为特征。Wernig等[6]发现，通过iPSC获取的神经上皮样细胞不仅具有神经前体细胞的典型形态，而且表达神经干细胞的表面标志物nestin、Sox2 和Brn2等。将该类神经前体细胞亚克隆移植入鼠胚的侧脑室，移植细胞在脑室内可分化为细胞簇，部分具有迁移至周围脑组织中的能力，分化成不同多巴胺能神经元。将这些多巴胺能神经元移植入成年PD鼠模型后，相关运动功能得到改善。Soldner等[7]建立了PD特异的iPSC系，并将其定向诱导分化为多巴胺能神经元。Nguyen等[8]将富亮氨酸重复激酶2基因突变患者来源的iPSC诱导分化为多巴胺能神经元发现α-突触核蛋白明显升高，并且细胞对过氧化氢、MG-132和6-羟多巴胺的敏感性增强。Byers等[9]建立了α-突触核蛋白三倍体患者的iPSC系，将其定向诱导为多巴胺能神经元后发现该方法能更好地模拟PD的早期病变过程。Liu等[10]证实，PD患者特异性iPSCs衍生的神经干/前体细胞核结构退化与富亮氨酸重复激酶2基因突变相关。Ryan等[11]发现线粒体毒素(包括农药百草枯、鱼藤酮等)可致PD-iPSC诱导的多巴胺能神经元A53Tα-突触核蛋白转录因子肌细胞增强因子2c发生s-亚硝基化，从而抑制肌细胞增强因子2c-过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α转录网络，导致线粒体功能障碍和细胞凋亡，最终导致A9多巴胺能神经元的丧失。Roessler等[12]建立了PD患者的iPSC系，并将其定向诱导分化为多巴胺能神经元，且该神经元具有PD疾病表型。Schöndorf等[13]通过研究葡糖脑苷脂酶1基因突变患者iPSC衍生的多巴胺能神经元，表明葡糖脑苷脂酶活性和蛋白表达降低，而葡糖神经酰胺和α-突触核蛋白表达水平增高，并存在自噬和溶酶体缺陷。并且蛋白组学检测发现该神经元内钙结合蛋白表达增加，并有钙稳态的调节障碍[13]。这些研究都证明PD疾病表型可通过特异性iPSC 模型体外重现，为深入研究该疾病的发病机制提供了细胞模型。

1.2 SMA SMA是一种常染色体隐性遗传病，是一类由编码1 型活运动神经元(survival motor neuron 1，SMN1)基因突变引起脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。Ebert等[5]研究证实，1型SMA患者来源的iPSC，与正常人来源的iPSC相比，iPSC衍生的神经元细胞内SMN1蛋白的表达降低，且其衍生的运动神经元的数量和体积都有较明显的降低。Corti等[14]发动神经元经基因修复后没有再出现如修复之前的疾病特异性表型。而且，将该种基因修复后的运动神经元移植入SMA小鼠模型体内不仅可延长其寿命且可减轻疾病的症状。

1.3 脊髓侧索硬化病(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) ALS病变常累及大脑、脑干、脊髓、颅神经核、脊髓前角细胞。由于累及范围广泛，患者通常表现为躯干、四肢和头面部肌肉慢性进行性变性，主要分家族性和散发性两种。家族性ALS主要是由于超氧化物歧化酶基因突变引起肌肉萎缩与瘫痪。Dimos等[15]将ALS患者来源的iPSC 诱导其分化为运动神经元，但未检测出表型改变。Mitne-Neto等[16]将ALS患者来源的iPSC模型诱导分化为运动神经元，并发现囊泡相关膜蛋白相关的蛋白B表达水平显著下降，表明ALS的发生可能与囊泡相关膜蛋白相关的蛋白B基因突变有关。Egawa等[17]报道由ALS患者来源的iPSC模型衍生的运动神经元表达异常高水平的突变反式激活反应DNA结合蛋白43(TAR DNA binding protein-43，TDP43)。Burkhardt等[18]则发现散发性ALS患者来源的iPSC模型诱导分化的运动神经元细胞核内有大量TDP-43蛋白聚集，说明可能是因为TDP-43蛋白的大量聚集导致功能性TDP-43蛋白水平的降低，使TDP-43蛋白功能减低，进而造成运动神经元的凋亡，最终导致疾病的发生。Nishimura等[19]发现TDP-43基因突变的ALS患者来源的iPSC模型诱导分化的神经元细胞质中TDP-43蛋白是正常对照组的2倍，而通过RNA干扰技术对ALS患者来源的iPSC 模型的突变TDP-43基因进行干扰发现细胞质中TDP-43蛋白减少了30%，由此可以推断RNA干扰技术或许可以作为ALS的治疗手段应用于临床。

1.4 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD) AD是老年人常见的神经系统变性病，临床特征为隐袭起病，进行性智能衰退，多伴有人格改变。病因迄今未明。病理上，患者呈弥漫性脑萎缩， 并出现老年斑、神经纤维缠结、海马椎体细胞颗粒空泡变性及神经元缺失。Seshadri等[20]发现，导致AD的主要遗传因素为载脂蛋白E、早老素(presenilin,PS) 1、PS2、淀粉样肽前体蛋白基因突变。Yagi等[21]建立了PS1和PS2基因突变的iPSC系，并诱导分化为神经元细胞。该神经元细胞内较正常对照组有较多的β-淀粉样蛋白42分泌，证实了β-淡粉样蛋白聚集导致AD发病的机制。Kondo等[22]发现，由淀粉样肽前体蛋白基因突变AD患者来源的iPSC模型诱导的神经细胞中Aβ肽的聚集导致内质网应激和氧化应激，进而引起神经细胞的丧失。进一步研究发现，二十二碳六烯酸疗法可以减轻这种应激反应，这证明二十二碳六烯酸疗法对于AD治疗的临床价值。

1.5 亨廷顿舞蹈病 (Huntington′s disease, HD) HD是一种呈常染色体显性遗传的大脑变性疾病，主要症状为舞蹈样动作和进行性认知障碍。病因主要是由于IT15基因中出现多个串联的CAG重复序列，由此产生异常的神经性舞蹈病蛋白，从而造成细胞毒性而发生神经细胞的变性改变。当CAG重复超过40个时即可导致本病的发生，CAG重复序列扩增越多，患者的起病年龄越早。Zhang等[23]发现，HD患者iPSC来源的纹状体神经元和神经前体细胞具有和HD患者相似的CAG重复序列，易于受到损伤后凋亡。Cheng等[24]研究发现，miR-196a可降低HD患者来源的iPSC诱导的神经元细胞内神经性舞蹈病蛋白的病理性聚集及过度表达，从而证明miR-196a对HD的潜在治疗价值。

2 iPSC在神经变性疾病药物筛选中的应用

疾病特异性iPSC衍生的特定神经元细胞可作为人体细胞模型用于高通量药物筛选。目前， iPSC在神经系统变性疾病药物筛选的研究中已逐步被应用。Ebert等[5]研究证实，丙戊酸和妥布霉素显著增加SMA小鼠模型核基因的表达，相关实验也证实SMN1 蛋白显著增加。Kondo等[22]报道，不同AD患者的iPSC模型衍生的神经元细胞对药物治疗有不同的反应，显示了患者特异的iPSC模型在个体化治疗中的的潜在价值。2014年Asai等[25]应用患者AD来源的iPSC模型衍生的神经元细胞进行个体化的药物筛选。iPSC的产生为高通量药物筛选带来了新的机遇。

3 应用诱导多能干细胞存在的问题及面临的挑战

目前，已建立了部分神经系统疾病的iPSC系，为人们对疾病机制研究开辟了新的路径。然而，iPSC应用于临床也存在诸多问题，面临巨大的挑战。大量研究表明，遗传物质在体细胞重编程的不同阶段都可能发生各种不同形式的变异，而这种变异具有潜在的致癌风险[6,26-27]。因c-Myc和Klf4属于致癌因子，且以病毒为载体，这使致癌因子被整合到受体基因组内引起基因突变产生致癌性的iPSC的可能性大大增加。同时，iPSC产生的效率比较低，且实验耗时长，来源于多能干细胞的组织在移植后的存活率很低。这些问题是iPSC在临床上广泛应用的诸多障碍，因此， 建立安全、高效、符合临床标准的iPSC是将其应用于临床的必要条件，也是目前所要解决的关键问题。

4 小 结

因ESC研究涉及诸多法律、伦理、宗教等问题而受到很大制约，而iPSC则避免了这些缺点。目前，疾病患者特异的iPSC建立的模型为研究疾病的发病机制和探究新的、个体化的治疗方案提供了新的思路，但若进一步进行细胞治疗还有很多问题有待解决，如需建立安全、高效、无创的iPSC获取方法；需完善iPSC定向诱导分化的方法；需有效、统一的体细胞重编程和诱导分化的评估系统；需探索疾病特异性iPSC诱导分化的神经细胞移植后在体内维持稳定生长和增殖的方法；建立个性化的iPSC库等。总之，iPSC不仅可为神经系统变性疾病研究和药物筛选提供细胞模型， 还可为疾病诊疗方案的研究提供新的诊疗思路， 因此无论在理论研究方面还是临床实践中都具有无可取代的价值。由此可知随着不同疾病iPSC 系的不断建立，各种神经变性疾病的发病机制将逐步被发现，神经系统疾病将进入个体化治疗的新时代。

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The Research and Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Neurodegenerative Disease

DONGJian-jian1,2,CHENGNan2,HANYong-zhu2.

(1.GraduateSchool,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230038,China； 2.DpetartmentofNeurology,NeurologicalResearchInstituteAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Hefei230061,China)

Neurodegenerative disease is characterized by slow onset,progressive development and poor prognosis.In recent years,the morbidity of neurodegenerative disease is rising constantly.But there is still no effective clinical therapy, and their pathogenesis remains unclear.Along with the progress of the technology of somatic cell reprogramming,patient-specific induced pluripotent stem cells(iPSC) have been gradually applied as in vitro models for the study of the pathogenesis of neurodegenerative diseases,drug screening and clinical treatment.However,the technology of somatic cell reprogramming is still in its early stages,and there are still problems such as potential carcinogenic risk and low productivity etc.,therefore the researchers should be devoted to establishing safe,efficient and clinically qualified iPSC.

Neurodegenerative diseases; Induced pluripotent stem cell; Somatic cell reprogramming; Cell model

国家自然科学基金(81072738；81173212)

R741

A

1006-2084(2015)12-2120-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.004

2014-09-09

2014-12-01 编辑：相丹峰