川芎嗪干预心力衰竭犬心房纤维化及MMP-2与TIMP-2的mRNA表达研究

林亚洲，陈林，连亮华，吴梅琼，陈建泉，杨志平

1.福建省立医院心内二科，福建福州 350001；2.福建医科大学省立临床医学院，福建福州 350001

心房纤维化是心力衰竭（HF）时心房颤动（AF）发生与维持的重要病理基础。HF 时肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活，可导致包括胶原蛋白在内的细胞外基质（ECM）蛋白合成增加[1]。基质金属蛋白酶（MMPs）家族与其内源性组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的基因表达及活性在心肌的纤维化进程中起重要作用[2-3]，其中MMPs 能特异性降解ECM 成分。中药制剂川芎嗪具有多重生物学及药效学效应，其化学结构为四甲基吡嗪（TMP），临床既可以应用于HF 又可以用于治疗器官组织纤维化[4-5]，但目前用于防治AF 与心房组织纤维化及其相关机制尚无文献报道。该研究从2013年9—12月将21 只实验犬分为对照组、HF 组及TMP 干预组。通过心室快速起搏建立HF 模型并予以川芎嗪治疗，观察AF 诱发情况、检测心房纤维化程度、运用逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）测定左右心房组织的MMP-2、与TIMP-2 的mRNA 表达，探讨HF 时心房纤维化与MMP-2/TIMP-2 的关系以及川芎嗪干预的疗效和作用途径，为中医药防治HF 与AF 提供客观依据与可能的途径，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

健康杂种犬21 条（2013年9—12月由福建中医药大学动物实验中心提供并饲养），体重（16±4）kg，犬龄（3.2±1.0）岁，雌雄不拘，实验犬随机分为3 组：对照组（Control）7 只，HF 组7 只和TMP 治疗组7只。

1.2 HF 组模型建立、AF 的诱发及药物处理

快速心室起搏致HF 模型建立以及AF 的诱发参照既往研究[6]，诱发的AF 持续超过15 min 则定义为持续性AF。TMP 组模型建立开始即给予TMP （国药准字H32023383，无锡市第七制药有限公司）治疗，剂量为10 mg/（kg·d）肌肉注射。

1.3 标该研究采集与心房组织学检测

所有实验犬在诱发AF 后，取左右心房游离壁，漂洗干净后10%福尔马林固定，石蜡包埋切片。Mallory 氏三色法染色，肌组织呈鲜橘黄色，胶原纤维呈深蓝色，SigmaScan4.0 图像分析系统检测纤维化百分比。另取左右心房组织约100 mg 转入深低温冰箱-70 ℃保存待测mRNA 的表达。

1.4 RT-PCR 方法

从Genbank 查获目标基因MMP-2、TIMP-2 和内参照基因β-actin 的mRNA 序列；运用Primer Express 设计目标基因MMP-2（346bp，上游5’-GCC CCA AAG AGA GAT GCA ACC TAT-3’，下游5’-CGG CCA AAG TTG ATC ATG ATG TC-3’）、TIMP-2（529bp，上游5'-GAT CCA GTA TGA GAT CAA GC-3'，下游5'-ATG TCA GAG CTG GAC CAG TC-3'）和β-actin（111bp，上游5'-CTC CAT CAT GAA GTG TGA CGT T-3'，下游5'-ATC TCC TTC TGC ATC CTG TCA G-3'）的上下游引物，所有引物由TaKaRa 公司合成。取心房组织100 mg，参照Gibco 公司的Trizol RNA 提取说明书流程提取组织总RNA，并鉴定RNA 纯度与完整性。按逆转录常规操作，进行RT-PCR 扩增，94 ℃预变性5 mim 后进入PCR 循环，各目标基因退火温度均为58 ℃。各目标基因共扩增产物和β-actin 在同一反应体系中电泳，在ImageMaster VDS-CL 凝胶成像系统上扫描，测各目标基因和β-actin 条带的OD 值,以两者比值代表各目标基因的相对表达含量。

1.5 统计方法

所有统计处理由SPSS15.0 统计软件包完成，计量资料用均数±标准差（±s）表示，并采用t 检验，计数资料采用[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心房颤动诱发结果与纤维化程度比较

与对照组相比，HF 组与TMP 组的AF 易于诱发，其AF 与持续性AF（SAF）诱发率均明显增加，AF 持续时间（DAF）明显延长，左右心房纤维化程度均有显著增高，HF 组的AF 持续时间与左心房纤维化程度呈高度正相关关系（r=0.841，P=0.018）。TMP 组与HF 组相比，持续性AF 的诱发率明显降低，左右心房的纤维化程度分别降低51.5%和32.5%，见表1、表2，图1～3 所示。

图1 对照组心房组织（Mallory 氏三色法×20）：组织内未见纤维化

图2 HF 组心房组织（Mallory 氏三色法×20）：组织纤维化明显，由增生的成纤维细胞、大量的胶原成分以及脂肪细胞等组成细胞间连接组织明显增加

图3 TMP 组心房组织（Mallory 氏三色法×20）：心房肌间质纤维组织增生明显减少

表1 各组心房颤动诱发率比较

表2 各组心房颤动持续时间及纤维化程度比较（±s）

表2 各组心房颤动持续时间及纤维化程度比较（±s）

注：与Control 比较*P＜0.001，与HF 比较#P＜0.05，##P＜0.001。

指标Control(n=7)HF(n=7) TMP(n=7)DAF（S）fibrosis of RA（%）Fibrosis of LA（%）3.24±3.56 2.88±0.45 3.05±0.46(462.1±181.4)*(8.36±1.46)*(11.25±1.76)*(340.6±162.6)*(5.64±0.99)*#(5.46±1.14)*##

2.2 各组目标基因mRNA 表达的变化

在右心房中，HF 组与对照组比较，MMP-2 的mRNA 表达显著性升高，增加65.7%，TIMP-2 虽无明显变化，但MMP-2/TIMP-2 仍增高106.1%。在左心房中，HF组与对照组比较，MMP-2 的mRNA 表达量显著升高，增加达到100.0%。TIMP-2 则降低46.3%，MMP-2/TIMP-2 增高285.3%。TMP 组与HF 组比较，TIMP-2 的mRNA 表达明显增高，M MP-2 的mRNA 表达和MMP-2/TIMP-2 比值显著降低，见表3，图4～5所示。

表3 各组目标基因mRNA 表达的比较（±s）

表3 各组目标基因mRNA 表达的比较（±s）

注：与Control 比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与HF 比较，#P＜0.05，##P＜0.01,###P＜0.001。

指标Control(n=7)HF(n=7) TMP(n=7)RA LA MMP-2/β1-actin TIMP-2/β2-actin MMP-2/TIMP-2 MMP-2/β1-actin TIMP-2/β2-actin MMP-2/TIMP-2 0.70±0.22 2.20±0.56 0.33±0.10 1.54±0.45 4.47±0.87 0.34±0.09(1.16±0.40)*1.85±0.52(0.71±0.46)*(3.08±0.76)***(2.40±0.61)***(1.44±0.73)***0.85±0.32 2.30±0.55 0.43±0.26(1.77±0.50)##(3.94±0.79)##(0.49±0.23)##

图4 MMP-2 的mRNA 表达：1=右房对照组，2=右房HF 组，3=右房TMP组，4=左房对照组，5=左房HF 组，6=左房TMP 组，M=50bpDNA 梯

图5 TIMP-2 的mRNA 表达：1=右房对照组，2=右房HF 组，3=右房TMP 组，4=左房对照组，5=左房HF 组，6=左房TMP 组，M=50bpDNA梯

3 讨论

心房纤维化可以导致心房内不应期及传导时间延长、微折返形成，是HF 时AF 发生与维持的主要基质因素。川芎属于活血化瘀兼有行气作用的中药，川芎嗪是化学结构为四甲基吡嗪（TMP）的一种有效活性生物碱，临床上广泛用于拮抗肝、肺、肾等组织器官的纤维化治疗[5]。

该研究也显示，HF 组的心房纤维化程度明显高于对照组，且AF 持续时间与左心房纤维化程度呈密切正相关，证实心房纤维化可以参与AF 的发生与维持。相对于HF 组，TMP 组的左右心房的纤维化程度分别降低51.5%和32.5%，而且持续性AF 诱发率明显降低达50%，AF 持续时间有所缩短，提示川芎嗪可以通过改善心房纤维化进而减轻AF 的发生与维持。

心脏由以心肌细胞为主的各种细胞和以胶原为主的ECM 组成，ECM 的变化、动态平衡的破坏是心脏重构的重要原因[7]。MMPs 是降解ECM 成分的最主要蛋白水解系统，属于内源性锌离子依赖性酶家族，TIMPs 是MMPs 的内源性特异性抑制剂。二者的相互作用与相互影响决定了心肌ECM 重构过程的进展[8]，多数研究显示MMPs 表达的异常增高伴随着组织纤维化的增加，其主要原因是MMPs 通常降解具有正常结构和功能的胶原蛋白，随后被其他缺乏连接结构的异常纤维性间质取代[9-11]。

我们的研究结果显示，MMP-2 的mRNA 表达在左右心房中均明显升高、而TIMP-2 降低，提示MMP-2/TIMP-2 在mRNA 水平的调节失衡可能导致异常的胶原增生，应该是HF 时心房纤维化与AF 的发生维持的分子基础之一。提示若要改善HF 时心房纤维化、预防和减少AF 发生与维持，则通过调节MMPs/TIMPs 的平衡及其相关调控因子活性和表达，可能是的新的有效途径，但目前这方面的临床与实验研究均未见相关文献报道。

有研究提示，川芎嗪可以通过减少MMP-1 表达来减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化程度[12]，亦可通过下调MMP-9、TIMP-1 表达,进而减缓肾纤维化的病程进展[13]。

该研究在基因转录水平检测川芎嗪对MMPs/TIMPs调节的结果显示：与HF 组相比，右心房中，川芎嗪组MMP-2 的mRNA 表达下降26.7%，MMP-2/TIMP-2 比值下降39.4%，左心房中则分别下降42.5%和65.9%，而TIMP-2 则上调64.2%；各参数与对照组无显著性差异。而且随着MMP-2 与TIMP-2 基因mRNA 表达的趋向正常化，心房纤维化得到明显的改善。提示川芎嗪通过上调TIMPs 的基因表达，从而加强对MMPs 的抑制，促使MMPs/TIMPs 的平衡恢复到相应水平，进而改善HF 时心房纤维化的程度与进程的发展。

综上所述，川芎嗪通过有效地调节MMP-2 与TIMP-2 的mRNA 表达改变，从而并促进MMP-2/TIMP-2 平衡恢复，减少异常结构的纤维组织在心房中的堆积，可能是其改善心房纤维化的分子机制，但其通过哪些相关基因表达与信号通路及其相应机制有待于深入研究；AF 的发生与维持机制仍有许多领域存在空白，我们同时也发现川芎嗪并不能完全阻断和逆转心房纤维化的进程与减少AF 的发作，这其中存在的其他途径、机制以及药物的剂量和治疗时间等因素有待深入研究。

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