新疆哈萨克族人群中扩张型心肌病与核纤层蛋白A基因变异的关系

纪禹同，张红涛，李耀东，周贤惠，李晋新，邢强，洪一帆，汤宝鹏

新疆哈萨克族人群中扩张型心肌病与核纤层蛋白A基因变异的关系

纪禹同，张红涛，李耀东，周贤惠，李晋新，邢强，洪一帆，汤宝鹏

目的：研究新疆哈萨克族人群中扩张型心肌病（DCM）与核纤层蛋白A（LMNA）基因变异的关系。

方法：对哈萨克族一个家族性扩张型心肌病（FDCM）31名成员，特发性扩张型心肌病（IDCM）160例患者（哈萨克族80例、汉族80例）分为IDCM组（哈萨克族,简称哈）、IDCM组（汉族,简称汉）及160例健康志愿者（哈萨克族80例、汉族80例）分为对照组（哈）、对照组（汉）进行LMNA基因检测。提取外周血DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增LMNA基因的12个外显子和外显子附近的内含子，对目的基因进行测序，测序结果与CHROMAS软件和PUBMED中BLAST软件中的标准模板进行对比，并分析突变位点与哈萨克族IDCM和汉族IDCM之间的关系。

结果：在哈萨克族FDCM的先证者中检测到LMNA基因7号外显子一未报道的单个碱基C插入（insC, CGG→CCG），导致精氨酸（Arg）变为脯氨酸（Pro）。在10号外显子上，检测到一个已被报道的LMNA基因多态位点rs4641（c.1362C＞T, His454His）。随后，在IDCM组（哈）和其对照组的LMNA基因检测结果中，得出LMNA基因多态位点rs4641的基因型分布（χ2=5.16，P=0.036）和等位基因频率（χ2=4.50，P=0.034）均存在统计学意义，而在IDCM组（汉）和其对照组中却差异无统计学意义。Logistic回归分析显示LMNA基因rs4641多态位点与IDCM组（哈）存在相关性[P=0.025，比值比（OR）=0.412，95%可信区间（CI）：0.189～0.896]。

结论：LMNA基因在新疆汉族和哈萨克族均有较高的患病率，但经统计后，发现LMNA基因rs4641多态位点与新疆地区哈萨克族DCM存在关联，可能是新疆地区DCM患者发病的易感基因多态位点。

扩张型心肌病；核纤层蛋白A基因；单核苷酸多态性；基因突变

Methods: A Kazak familial dilated cardiomyopathy (FDCM) with 31 members was studied. In addition, 160 patients with idiopathic dilated cardiomyopathy (IDCM) with 160 healthy controls were enrolled in our study, and they were divided into 4 groups: IDCM-Kazak, IDCM-Han and Control-Kazak, Control-Han. n=80 in each group. Peripheral blood DNA were extracted, 12 exons with nearby introns of LMNA gene were detected by PCR and the amplifed products were sequenced and compared with the standard template of CHROMAS and BLAST software to identify mutation sites. LMNA mutation in both Kazak and Han IDCM patients were investigated.

Results: A novel LMNA mutation (insC, CGG→CCG) at exon 7 was identifed in a FDCM proband, it caused an amino acid substitution as Arg to Pro, and a known LMNA polymorphism loci rs4641 (c.1362C＞T His454His) was fund at exon 10. In addition, LMNA polymorphism loci rs4641 genotype distribution (χ2=5.16, P=0.036) and allele frequency (χ2=4.50, P=0.034) were statistically different between IDCM-Kazak group and Control-Kazak group; while such

differences were no statistic meaning between IDCM-Han group and Control-Han group. Logistic regression analysis indicated that LMNA polymorphism loci rs4641 was related to IDCM occurrence in Kazak ethnics (P=0.025, OR=0.412, 95% CI 0.189-0.896).

Conclusion: LMNA polymorphism loci rs4641 was related to IDCM in Kazak ethnics at Xinjiang area, which might be susceptible loci for IDCM occurrence.

扩张型心肌病（DCM）是一种原发性心肌疾病，其主要临床特征是左心室或全心室扩张，引起收缩功能障碍，导致慢性心力衰竭、心律失常、猝死等心血管疾病的发生，并具有较高的发病率和死亡率。在排除已明确病因后，DCM患者中有35%～40%被诊断为特发性扩张型心肌病（IDCM），且家族性扩张型心肌病（FDCM） 在IDCM中比率高达35%[1]，这暗示遗传因素可能在疾病的发生发展中起到关键作用。2009年关于IDCM的诊断指南指出，对于DCM患者的直系亲属，也应进行基因筛查，评估患病的风险[1]。因此，对患者进行基因检测，不仅有利于患者疾病的确诊，也对其亲属的健康起到预防作用[2]。既往研究显示，DCM多为常染色体显性遗传，也存在常染色体隐性遗传和X连锁遗传[3]，多达40个基因已被确认为和DCM的发病有关[4]，其多数参与心肌的骨架、核膜和心肌蛋白、肌节蛋白和线粒体蛋白的编码[5]。当基因编码发生异常时，心脏的心肌细胞会出现结构与功能上的改变，导致心脏发生器质性病变，致使心肌的收缩和舒张功能下降，从而引起心肌疾病。核纤层蛋白A（LMNA），是导致DCM发病的常见基因之一，占引起FDCM的全部基因的5%～10%[6]。LMNA和C中间丝蛋白由LMN基因编码，是构成细胞核纤层的主要部分[7]。突变的LMNA基因可以导致人类发生多达11种疾病，如传导阻滞、骨骼萎缩、早衰症候群等，均被称为“核纤层蛋白病”[8]。分子遗传学研究表明，DCM伴发传导阻滞的患者中有30%是由LMNA基因突变引起的[9]。2005年加拿大、波兰和爱尔兰卫生组织联合声称有4.4%的DCM是由于LMNA基因突变引发的[10]，由此可知，LMNA基因突变与DCM的存在密切联系。

本研究选取哈萨克族FDCM的9名成员进行LMNA基因检测，发现家系先证者存在LMNA基因rs4641突变位点。继而收集哈萨克族和汉族的IDCM患者及健康志愿者，对与DCM相关的LMNA基因进行测序，旨在通过对新疆哈萨克族人群中DCM患者的LMNA基因研究，探究新疆哈萨克族人群中DCM与LMNA基因变异的关系。

1 资料与方法

受试者: （1） FDCM患者: 来自新疆维吾尔自治区布尔津县的哈萨克族家系，共计31名成员（其中男性17名，女性14名，年龄在2个月～70岁），目前已有5名成员被确诊为扩张型心肌病，其中已有3名成员死于扩张型心肌病，共采集血样9例，其家系图见图1。 对哈萨克族FDCM进行检测后，发现LMNA基因一突变位点与FDCM的发病可能存在关联性，在此基础上，收集哈萨克族和汉族IDCM患者及健康志愿者。（2） IDCM患者:均于2013-01至2014-12经新疆医科大学第一附属医院的门诊或住院确诊为IDCM的患者。80例IDCM组（哈萨克族,简称哈）患者，其中男42例，女38例；80例IDCM组（汉族，简称汉）患者，其中男45例，女35例；同时选取160例健康志愿者为对照组，其中80例哈萨克族为对照组（哈），男37例，女43例；80例汉族为对照组（汉），男56例，女24例。本研究方案经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会同意，并且所有受试者均签署知情同意书。

图1 哈萨克族家族性扩张型心肌病（DCM） 家系

IDCM患者的纳入标准：（1）左心室舒张末期内径（LVEDd）＞50 mm（女）和（或）55 mm（男）；（2）左心室射血分数（LVEF）＜45%；（3）X线胸片显示：心脏显影扩大，心胸比例＞50%。

排除标准（诊断依据参见文献 [11]）：引起心肌损害的其他疾病，如高血压、冠心病、心脏瓣膜病、先天性心脏病、酒精性心肌病、心包疾病、系统性疾病、肺心病和神经肌肉性疾病等。

临床资料搜集： 包括临床诊断，确诊时的年龄，家族史，心血管病史（心肌梗死、高血压、心肌炎），最大左心室壁厚度，LVEF等。

基因分析：抽取研究对象外周静脉血2 ml，提取DNA，根据PUBMED上LMNA（NM_001257374.2）基因的外显子序列，使用DNAMAN软件设计引物（表1）。进行聚合酶链反应（PCR），将PCR扩增产物纯化，采用DNAMAN系统对基因全部外显子序列进行测序分析，测序结果与PUBMED中BLAST软件和CHROMAS软件的标准模板序列进行对比分析，确定突变位点。对存在突变的位点再进行重复测序以证实突变。

表1 核纤层蛋白基因引物序列

统计学分析 ：临床数据以均数±标准差表示。用Hardy-Weinberg平衡检测样本的群体代表性。直接计数法计算基因型分布和等位基因频率，基因型分布和等位基因频率采用卡方（χ2）检验。计量资料采用方差分析。数据均采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

FDCM患者：FDCM患者中5名成员被确诊为FDCM（本研究中FDCM仅涉及家系的直系成员），先证者的父亲病逝于心血管疾病，具体不详。

IDCM组（哈）、 IDCM组（汉）及其对照组基线资料（表2）：IDCM组（哈）与其对照组比较LVEF降低、LVEDd升高，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。IDCM组（汉）与其对照组比较LVEF也降低、LVEDd升高，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。其余指标间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 特发性扩张型心肌病组（哈）、（汉） 及其对照组基线资料

表2 特发性扩张型心肌病组（哈）、（汉） 及其对照组基线资料

注：LVEF：射血分数；LVEDd：左心室舒张末期内径；IDCM：特发性扩张型心肌病。与对照组（哈）比较*P＜0.01; 与对照组（汉） 比较ΔP＜0.01

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基因检测的结果：对目的基因进行检测后，在FDCM先证者的7号染色体上发现一未报道的突变位点，在FDCM发现一已报道的SNP位点rs4641。同样，在IDCM及对照者中也发现LMNA基因SNP位点rs4641。对LMNA基因的其余外显子和附近的内含子均未检测到突变位点。对既往文献中提过的与DCM相关的LMNA基因SNP位点（rs553016、rs505058、rs142000963、rs17847249等）再次重复检测，也并未发现突变。（1）FDCM突变位点：FDCM中，在先证者Ⅲ-5的1号染色体上的7号外显子中，检测到一个碱基的插入，导致其后的碱基序列发生变化，在第1066位碱基处插入胞嘧啶C（ins C，CCGGG→CCCGG），导致精氨酸（Arg）变为脯氨酸（Pro）。先证者的基本资料和临床资料显示，患者男，33岁，哈萨克族，因活动后胸闷、气短入院。体格检查：端坐呼吸，颈静脉怒张，右下肺叩诊浊音，未闻及湿啰音，心界向左下扩大，心音减弱，呈奔马律，肝肋下4指，肝颈静脉回流征阳性。已病逝。心电图显示：窦性心动过速、完全性右束支传导阻滞。超声心动图显示：全心腔扩大，LVEF：33%，LVEDd：71 mm，左心房68 mm，心包积液（23 mm液性暗区），心功能减低。X线胸片显示：心影增大，心胸比例＞0.5。同时，在FDCM的9名成员中，检测出已被发现的LMNA基因多肽位点rs4641，c.1362C＞T（rs4641，His454His，NM_001257374.1），位于10号外显子，该位点导致CAC→CAT，碱基发生改变，并没有导致氨基酸出现改变（图2）。（2）

IDCM的LMNA基因SNP位点（图3、表3和4）：对IDCM组（哈）、（汉）及其对照组进行了rs4641的检测，结果表明rs4641在哈萨克族和汉族基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验，具有群体代表性。rs4641在IDCM组（哈）和对照组（哈）之间的CC、CT、TT基因型分布 （χ2=5.16，P=0.036）及C和T等位基因频率（χ2=4.50，P=0.034） 差异均有统计学意义。而IDCM组（汉）和对照组（汉）之间的CC、CT、TT基因型分布（χ2=0.55，P=0.578）及C和T等位基因频率 （χ2=0.47，P=0.489） 差异均无统计学意义。经Logistic回归分析显示LMNA基因rs4641多态位点与哈萨克族IDCM患者存在相关性[比值比 （OR）=0.412, 95%可信区间（CI）：0.189～0.896，P=0.025]，rs4641可能是哈萨克族IDCM患者发病的易感基因多态位点。

图2 哈萨克族家族性扩张型心肌病（DCM）先证者核纤层蛋白基因突变

表3 两组患者核纤层蛋白基因的Hardy-Weinberg检测[例（%）]

图3 核纤层蛋白基因 多态位点rs4641

表4 rs4641基因型分布和等位基因频率在汉族和哈萨克族之间的比较[例（%）]

3 讨论

扩张型心肌病是导致心脏猝死和慢性心力衰竭的常见原因之一，是一种遗传因素和非遗传因素共同起作用的心肌疾病。LMNA基因是DCM最常见的致病性基因之一，位于1号染色体，全长56.7 kb，包含12个外显子，核纤层蛋白单体多聚形成蛋白网络状的核纤层，LMNA蛋白与其他核膜结构蛋白相互作用，组成细胞核膜，维持核膜稳定[12,13]。LMNA基因的突变大多可以导致DCM[14]。既往研究表明，LMNA基因突变导致的IDCM，在发病早期，患者的症状轻微或者并不明显，因此很难检测出，只有发展到后期，才会出现射血分数下降等一系列的表现，所以LMNA基因突变引起的心肌疾病多是以传

导系统的改变作为首发症状，如室性和房性心律失常、传导阻滞等[15]。rs4641突变的IDCM患者中有67%存在心律失常，如室性心动过速，Ⅱ度Ⅱ型房室传导阻滞等。本研究中的FDCM先证者首发症状为完全性右束支传导阻滞，后期才表现胸闷、气短等症状。LMNA基因不同位置的突变导致不同的临床症状[16]，Michels等[17]发现LMNA基因Argl90Trp不会导致患者出现传导阻滞的现象，FDCM患者中LMNA基因Ar9541Cys突变导致的心尖部室壁瘤是其首发症状，并且不伴有传导阻滞的表现[18]。这就可以解释为何本研究中的IDCM患者并不是100%出现心律失常。

研究中FDCM中的先证者检测出一个罕见报道的突变位点，碱基的插入导致整个密码子序列的发生改变，同时其也存在rs4641多态位点，这说明LMNA基因导致DCM的发生，可能是多个突变位点相互作用的结果，但是这一突变位点是否是其主要的致死原因，是否会遗传到下一代？本研究并未收集到FDCM中其他DCM患者的血标本。与此同时，美国Brodt等[19]研究表明随着年龄的增长，携带LMNA基因的DCM患者的外显率会增加。因此，本研究将继续对哈萨克族FDCM家族的其他成员进行定期检查和基因检测，并探究是否存在其余与DCM相关的基因。

单核苷酸多态性是人类遗传变异中最常见的一种，可达到突变基因的90%。研究中rs4641多态位点在哈萨克族的IDCM和健康志愿者中占38%，在汉族占48%，汉族的发病率比哈萨克族的高，但是汉族存在rs4641多态位点的患者与汉族志愿者比较没有统计学意义，而哈萨克族却存在。这是因为新疆地处偏远地区，且哈萨克族的饮食、生活习惯、居住环境等方面与汉族人群不同，最重要的是哈萨克族人口较少，且存在民族之间通婚的原因，导致突变的基因传到下一代的可能性大。汉族rs4641的检测率为48%，说明虽然遗传因素占有很大比重，但是环境等外界因素同样影响着DCM的发生。这与本研究的结果正好相符。

结论：LMNA基因多态位点rs4641可能是新疆哈萨克族DCM患者的易感基因多态位点，因此，对患者进行基因测序有助于疾病的早期诊断，并能够及时治疗和预防。同时，基因测序使疾病的诊断变得快速、简单，也可以在基因组水平上对患者进行医疗诊治和保健，并且对于评估FDCM的家庭成员是否存在DCM的风险是有一定意义的，故对无症状的IDCM患者进行早期诊断，可以起到预防的作用[20]。

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Relationship Between Dilated Cardiomyopathy and Nuclear Lamina Protein A Gene Mutation in Kazak Ethnics at Xinjiang Area

JI Yu-tong, ZHANG Hong-tao, LI Yao-dong, ZHOU Xian-hui, LI Jin-xin, XING Qiang, HONG Yi-fan, TANG Bao-peng.
Pacing and Electrophysiology Department, the First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi (830054), Xinjiang, China

Objective: To study the relationship between dilated cardiomyopathy and nuclear lamina protein (LMNA) gene mutation in Kazak ethnics at Xinjiang area.

Dilated cardiomyopathy; Nuclear lamina protein A gene; Single nucleotide polymorphisms; Gene mutation (Chinese Circulation Journal, 2015,30:1071.)

2015-05-12）

（编辑：梅 平）

国家自然科学基金（编号：81260069 ）

830054 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院 起搏电生理科 （纪禹同、李耀东、周贤惠、李晋新、邢强、洪一帆、汤宝鹏）；新疆维吾尔自治区阿勒泰地区布尔津县人民医院 内一科(张红涛)

纪禹同 硕士研究生 主要研究方向为心律失常学 Email：jytx2007@126.com 通讯作者：汤宝鹏 Email：tangbaopeng1111@163.com

R541

A

1000-3614（2015）11-1071-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.010