自组装和化学成分对腐植酸矿化影响的比较

Moustafa M. R. Khalaf Gabriela Chilom James A. Rice 著 张水勤 袁 亮 译

(1 美国南达科塔州立大学化学与生物化学系 布鲁金斯 SD57007

2 埃及米尼亚大学理学院化学系 米尼亚 61519

3 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 北京 100081)

天然的有机质是陆地生态系统中最大的碳库；土壤有机质(SOM)是生物碳库的4倍之大。SOM矿化向大气中排放的CO2比人为活动的排放量高一个数量级，这使得人们对SOM持久性的研究兴趣增加，并使通过土壤碳循环模型预测土壤及地表环境中SOM持久性方面的研究得到了长足的发展；而目前对调控SOM持久性分子过程的理解水平却限制了这些模型预测SOM对环境变化的长期响应能力。这些模型大部分通过用至少3个碳库来描述SOM参与碳循环的过程，这些碳库由生物学稳定性(不稳定、稳定、难熔和惰性)、分解速率(快速、中速和慢速)和周转时间(短、长、很长)定义。以上模型基于有机组分抗分解的主要原因是其化学结构的抗性作用机制。最近的研究挑战了抗性的概念且引入了一个新的基本概念来解释有机质存在的持久性，这种新兴的观点强调了仅有分子结构不能解释SOM的持久性，还需要考虑有机质与环境之间的交互作用。

最新的SOM分子集合模型也是基础概念的一部分，其强调了有机质组分之间及其与矿物质的交互作用，而非这些组分的自身化学组成特性。Wershaw(1994)认为SOM是“膜模型”中以溶液中的微团形式、土壤和沉积物中的包裹矿物颗粒双层膜形式存在的有序集；Piccolo(2001)提出了“超分子”模型，认为SOM是因分子间作用力和多分子间复杂性而异的较小分子聚集的超分子集合构造；Kleber等(2007)引入了“带状模型”，即SOM是多种以离散序列吸附在矿物表面的两性分子构成的混合物；Chilom和Rice(2009)认为SOM具有自然分层自组装或自组织的系统，该系统中各组分通过范德华力、氢键和疏水性等相互作用，以及以非共价或弱的交互作用有序排列。通过改变各组分之间交互作用的环境条件能够影响自组装过程。自组装和非自组装腐植酸热容量之间的比较，能够为SOM的自身组成提供直接依据。

组装材料的特性差异和其不同于原材料的行为能力是自组装的特征之一。比如，Sa lloum(2001)等对天然有机质样品进行分级，结果表明，标准有机碳1-萘酚的吸附系数(K0C)不同于其原材料。在SOM组织状态和微生物降解持久性方面数据的缺乏可能是决定环境中有机质稳定性的关键因素。

本研究的目的是通过区分有机质化学成分中组织的影响，定量评估有机质自组装对其微生物矿化作用的影响。文中进行了以下比较：(1) 样品的矿化是在同一原材料下，具有相同化学成分的样品进行物理混合来确定对自组装的影响；(2) 以化学成分和自组装作为变量影响矿化的相对重要性。该方法为有机质的组成状况如何影响SOM的稳定性和如何运用以上影响增加有机质在土壤中的残留时间提供参考。

1 材料与方法

1.1 有机质样品

本研究中所使用的原材料分别为：国际腐殖质学会提供的风化褐煤(LEO)和Pah ok ee泥炭(PP)，采自美国科罗拉多中部的一种被归类为Cr y oh emist的泥炭土，一种被归类为细粉质的混合了Udic Haploborolls的矿质土。后两种土壤分别代表了Guanella Pass泥炭(GP)和Poinsett粉壤土(PS)。以上材料提取的腐植酸化学成分变化较大,如风化褐煤的核磁共振(NMR)光谱结果表明，其腐植酸中几乎仅包含芳香族和脂肪族碳成分，而Poinsett粉壤土的腐植酸具有典型的腐植酸碳类型分布，这也是选取其作为研究材料的原因。

通过传统的碱提取方法从以上材料中提取自组装有机质。未进一步处理的原始腐植酸样品为HA0。根据Ch iolom等(2009)的提取步骤，按索氏提取法，用苯∶甲醇共沸混合物(3∶1，v∶v)保持72 h，提取出组分L0；移除L0，从H A0提取出的组分为H A1。之后用碱浸提L0组分，进一步分离，获得两性组分HA2和脂质组分L1。具体分级见图1。

图1 从原材料中分离腐植酸(HA0)及其组分(HA1，L0，HA2，L1)的步骤示意图Fig.1 Schematic diagram of the procedure to isolate humic acid (HA0) and its fractions (HA1, L 0, HA2, L 1)from source materials

每个样品的碳质量平衡，计算初始物料中每种组分的丰度。根据碳质量平衡，按严格的比例，混合各自最初状态下的组分，从而分别得到H A0和L0的物理混合物。第1种混合物为与H A0相对应的H A0/3，是H A1、H A2和L1的混合物；第2种混合物为与L0相对应的L0/2，是HA1和L1的混合物。

运用日本岛津公司总有机碳分析仪测定所有样品中有机碳含量。该仪器的工作原理是：自由CO2气流作用下，有机质催化氧化，通过红外吸附测定CO2的量，得到样品中有机碳含量。

1.2 矿化试验

营养液组成及配制方法如下：3 g NaNO3、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O和0.01 g FeSO4溶于1 L无菌去离子水。按照先前步骤中所描述，以有机质样品充当该试验的唯一碳源，即将70～100 mg干有机质样品添加至装有100 m L营养液的250 m L耐热玻璃瓶中。向该溶液中添加0.1 M NaOH使该溶液最终p H为7.5。玻璃瓶旋盖用硅/聚四氟乙烯材质，气体进出口用聚四氟乙烯管填充。每天通过进口管向玻璃瓶通入CO2自由气体15 min，而此时出口管保持打开状态以维持培养试验期间的有氧环境。其他时间，通过2个阀门的关闭系统。

从新鲜的Poinsett粉壤土土样中获得菌剂，4 ℃保存，备用。土壤样品中加100 m L无菌去离子水制成悬液，往复式振荡机剧烈过夜振荡。该悬浮液用微量的葡萄糖(0.5 g/L)浓缩，置于暗处，37 ℃条件下保存24 h。用一次性的无菌注射器分取该悬浮液0.5 m L，通过硅/聚四氟乙烯管分别加入每个含有SOM和营养液的玻璃瓶中。每个有机质样品和对照(仅有营养液和SOM溶液)均设置3个重复，将其置于回旋式振荡器上(暗处、室温条件下)振荡125天。通过烧瓶封口片用无菌注射器定期从瓶中移出少量的培养液以测定p H，保证试验处于恒定的环境；同时，运用连续的稀释和Czapek-Dox琼脂板固定检测细菌的生长状况。

培养后期，3个重复的溶液合成1个，并用H Cl酸化。将上述溶液离心过滤以分离出沉淀中的有机质，45 ℃下真空电炉干燥后，研成粉末，称重并测定其有机碳含量。通过计算有机碳初始量和培养后量的差别，得出矿化量，以初始有机碳含量的百分数表示。根据初步短期矿化试验结果，风化褐煤和Guanella泥炭的标准偏差低于10%。由于以上样品不进行其他的分析，因此，分别对每个样品短期矿化试验碳含量进行了3次测定。

1.3 13C固态核磁共振光谱

主要碳组分的相对丰度用13C固态核磁共振光谱检测，从而了解培养前后有机质样品的化学构造。检测仪器为布鲁克公司生产的A v an ce 300光谱仪，在频率为75 MH z和高速旋转(13 k H z)条件下，与通过CP/T1振荡试验中获得的T1C修正相结合，用直接偏振魔角旋转(DPMAS)记录13C核磁共振光谱结果。有机质样品直接决定了DPMAS的循环延迟时间，在3～6 s之间。将样品塞入带有聚三氟氯化乙烯盖子、直径为4 mm的氧化锆转子里，如果样品量有限，可向转子中加入铝土等惰性材料以确保样品位于探测器线圈之内。通过以下化学位移区域整合13C核磁共振光谱以确定碳组分含量：0～50 ppm，烷基碳；50～108 pp m，氧烷基碳；108～160 ppm，芳香碳；160～212 ppm，羧基/羰基碳(运用软件扩充光谱仪操作系统)。有机质的疏水性指数以(烷基碳+芳香碳)与(烷氧基碳+羧基碳)的比率计算。

1.4 差示扫描量热法

用装有LT C-50低温冷却组件的日本岛津公司DSC-50差示扫描量热仪开展差示扫描量热法试验，用铟和锌标准物的熔解温度和人造蓝宝石(NISST SRM 720)热容量校准仪器。通过连续3次测定结果得到样品的热容量，第1次测量池为空，第2次用参考材料(人造蓝宝石)充满，第3次用需要检测的样品充满，整个测定过程参比池均为空。每个试验从测定开始到最终结束，均以5 ℃/min加热速度，将温度从10 ℃升至70 ℃，且保持等温时间5 min。为确保痕量水分或有机溶剂的移除，所有样品均置于60 ℃真空电炉中保存24 h，称重，预热(以20 ℃/min速度将温度从室温升到100 ℃，保持30 min)。所有试验均用未封口标准铝池。

2 结果

2.1 有机质样品的组成

每个H A0及其组分的13C DPMA S固态核磁共振光谱如图2所示。在烷基(0～50 p p m)、氧烷基(50～108 ppm)、芳香族(110～160 ppm)和羧基/羰基(160～220 ppm)的光谱区域均出现了宽且明显的碳峰。烷基区域的面积受29 p p m处的峰所控制，表明长链聚亚甲基结构的存在。此外，在15 p p m和20 p p m处还出现了其他双峰，这是由于短链碳氢化合物和长链烷类聚合物的末端碳原子存在。在氧烷基区域72 p p m处出现了共振现象，表明了糖类、纤维素、乙醇和(或)醚的存在；50～60 ppm处是甲氧基、次甲基和季碳的特征峰；肩峰的存在通常归因于陆生材料中木质素的存在。芳香碳共振区域主要受129 ppm处峰值的影响，该峰值的出现表明未被取代的和被烷基取代的芳香碳的存在。145～162 p p m化学位移处的共振说明了酚碳的存在。羧基碳区域的主要峰值位于172 ppm处，表明了羧基、酯和氨基化合物碳的存在。

图2 腐植酸(HA0)及其组分(HA1，L0，HA2，L1)的13C DPMAS固态核磁共振光谱Fig.2 13C DPMAS solid state NMR spectra of samples of humic acid (HA0) and its fractions (HA1, L 0, HA2, L 1) derived from Guanella peat (a), Poinsett soil (b), Pahokee peat (c) and leonardite (d)

原始腐植酸样品(H A0)中，不同的碳类型分布规律揭示了样品之间的相似与独特之处。风化褐煤、Pahokee泥炭、Poinsett土壤和Guanella泥炭4种原始H A0样品除风化褐煤外，其他3种样品中的羧基/羰基碳相对含量相似。该4种样品的氧烷基碳相对含量的规律与羧基/羰基碳相对含量的规律一致。Guan ella泥炭H A0样品中的烷基碳含量最高，数值达41%；而其他3种H A0样品中烷基碳含量相似，数值在15%～20%的范围之内。风化褐煤H A0样品中芳香碳含量最高，数值达56%；而Pahok ee泥炭、Poinsett土壤和Guanella泥炭3种H A0样品中芳香族碳的含量依次降低，分别为43%、34%和19%。

以有机溶剂和水为浸提剂，浸提得到来源于风化褐煤、Pah ok ee泥炭、Poin set t土壤和Gu an ella泥炭4种材料的H A0中不同碳类型的分布，如表1所示。有机溶剂可浸提出以有机酸脂质混合物L0形态存在的碳，该碳的百分比的范围在16%～30%之间。该浸提过程提取了约一半的烷基碳和三分之一的其他类型碳。因此，H A1的烷基碳相对含量有所减少，但芳香碳的相对含量则高于原始H A0样品。4种材料中H A1组分与H A0样品的芳香性具有的变化趋势相一致。用水浸提L0混合物能够从两性的腐植酸组分中分离出脂质组分。该脂质组分含有特定的烷基碳(其主要光谱位于烷基峰处)，而H A2组分的光谱结果则表征了烷基、烷氧基和羟基/羧基碳的存在，且H A2组分中烷基碳的相对含量高于原始腐植酸样品中烷基碳的相对含量。

风化褐煤、Pah ok ee泥炭、Poin sett土壤和Guanella泥炭的4种材料的自组装样品(HA0和L0)及其相应物理混合物(H A0/3和L0/2)的相对碳类型分布，如表2所示。试验结果表明，自组装样品(H A0和L0)及其相应的物理混合物(H A0/3和L0/2)的试验误差完全一致；它们化学成分相似，表明提取过程中其化学成分没有发生大的变化，因此有机质的化学改性使微生物降解行为出现差异的可能性极小。

表1 不同来源的腐植酸样品中有机质组分a分布百分比*Tab.1 Percent distribution of organic matter fractionsa obtained from humic acid samples originating from different source materials

表2 从13C DPMAS核磁共振光谱计算得到的自组装样品及其相应物理混合物的相对碳类型分布aTab.2 Relative carbon-type distributionsa of self-assembled samples and their corresponding physical mixtures calculated from 13C DPMAS NMR spectra

2.2 有机质样品的自组装

由于材料的比热容与其结构直接相关，因此，在先前的研究中，我们提出可运用比热容来获取复杂的可溶性有机碳中的结构信息。经过原始自组装腐植酸(HA0，L0)及其对应物理混合物(HA0/3，L0/2)比热容的比较测定结果表明，腐植酸有连续2个组织结构。L0是第1层次，其是两性分子H A2和类脂L1交互作用合成的材料。H A0是第2层次，其是L0和H A1交互作用的结果。第1层次的特征是比热容增加，而第2层次的热容量则降低(表3)。热容量的减少被普遍认为是分子间相互作用的增加或交联，从而使结构更加紧实、柔韧度变差。Larson等(1997)认为，低品位煤暴露在溶胀溶剂中形成一个高度相关的结构，其热容量增加。与相对应的扩展部分(即体积)相比，纳米晶体材料表面能部分对系统整体能量贡献更大，因此，其被观察到热容量增加。Chilom和Rice(2009)认为第一有机质组织层次(L0的产物)热能量的增加是由于纳米级结构L0的形成，因此，L0和H A0的样品测定结果均支持自组装结构的形成和比热容的变化。与HA0样品相比，L0样品的比热容变化更大，综上表明这些样品结构组成更为广泛。

表3 20～50 ℃范围内自组装样品及其相应混合物平均比热容的差异Tab.3 Differences in the specifi c heat capacities (C P) of the self-assembled samples and their corresponding mixtures averaged for the temperature interval of 20～50 ℃

2.3 样品的矿化

溶解性有机质样品作为单一碳源培养125天后，其被土壤微生物矿化的程度存在差异，试验测得的矿化值恰好在关于土壤腐植酸微生物降解研究测得值的范围内。

4种材料HA0样品的矿化显出较大变化(图3)。Guanella泥炭的HA0样品碳矿化率最高，为43%；随后是Poin sett土壤、Pah ok ee泥炭和风化褐煤的，分别为28%、18%和6%。

图3 从Guanella泥炭(GP)，Poinsett土壤(PS)，Pahokee泥炭(PP)和风化褐煤(LE0)分离出的腐植酸(HA0)样品的矿化率Fig.3 Mineralization of humic acid (HA 0) samples isolated from Guanella peat (GP), Poinsett soil (PS),Pahokee peat (PP) and leonardite (LEO)

各组分比较结果(图4)表明，所有材料中L0的矿化程度最高，占总有机碳的35%～43%。两性腐植酸组分H A2和脂质组分L1的矿化程度分别为20%～44%和13%～30%。微生物似乎对每种材料中H A1组分的利用最少，整个试验中该组分仅有4%～26%发生了矿化。

图4 分离出的各腐植酸组分(HA1，L0，HA2和L1)的矿化率Fig.4 Mineralization of humic acid fractions (HA 1, L 0, HA 2,and L 1) isolated from Guanella peat (a), Poinsett soil (b),Pahokee peat (c) and leonardite (d)

研究中L0矿化程度大多高于其相应的物理混合物(L0/2)(图5a)。H A0的连续矿化模式高于物理混合物H A0/3(图5b)，尽管4个样品中有3个的差异均未达到显著水平(P=0.05)。物理混合物L0/2和HA0/3的矿化行为与其各组分矿化总量相等。

图5 从Guanella泥炭(GP)，Poinsett土壤(PS)，Pahokee泥炭(PP)和风化褐煤(LEO)分离出的自组装样品及其相应物理混合物的矿化率Fig.5 Mineralization of self-assembled samples and their corresponding physical mixtures, L 0 vs L 0/2 (a); HA 0 vs HA0/3 (b) isolated from Guanella peat (GP), Poinsett soil(PS), Pahokee peat (PP) and leonardite (LEO)

2.4 生物降解下有机质样品化学组成的变化

用13C固态核磁共振光谱对培养125天后的有机质进行表征，并与培养前的样品进行比较，评估每个样品化学组成的变化。计算每个样品培养前后相对的碳类型分布作为每个峰区所占面积与光谱分析总面积的比例，这一比例和总有机碳被用于后面计算培养前后样品中碳类型的绝对量。培养前后从Guanella泥炭、Poinsett土壤、Pahok ee泥炭、风化褐煤4种材料中分离出的自组装样品(H A0，L0)、物理混合物(H A0/3，L0/2)及组分(HA1，HA2，L1)的碳类型分布见图6。

矿化后，H A0样品中烷基碳和氧烷基碳减少。从Guanella泥炭、Poinsett土壤、Pah ok ee泥炭提取的H A0样品中烷基碳和氧烷基碳减少50%～60%，而从风化褐煤提取的H A0中约减少20%。培养125天后，H A0样品中未发现芳香碳和羧基碳的变化。

培养前后的4种材料组分中烷基碳和氧烷基碳也表现出了明显且一致性的降低趋势。大多数H A1组分未观察到其余碳类型的其他变化。L0中各类型碳均有所降低，包括芳香碳和羧基碳，其中，L0中有1/3的芳香碳和平均40%的羧基碳均被矿化。H A2组分中烷基碳和氧烷基碳降低，4个样品中的芳香碳均降低，而H A2的羧基碳未发现变化。L1组分的烷基碳降低，而羧基碳有轻微增加趋势。

培养125天后，L0与物理混合物L0/2的碳类型分布不完全相同。其中，物理混合物L0/2的烷基碳和氧烷基碳均降低，大部分物理混合物L0/2的芳香碳没有发生变化，且羧基碳呈现出不明显的降低。物理混合物H A0/3的碳类型分布状况与HA0样品相同。

试验开始时样品有机质和培养125天后样品剩余有机质存在差别，可能是由于存在优先矿化和(或)生物量的形成两种过程，而已使用的分析不能区分出具体为哪种过程。由于核磁共振光谱中没有出现新的特征峰，培养后的样品有机质中未检测到羧基/氨基碳类型(例如核磁共振光谱中160～220 p p m)的增加，因此，我们推测优先矿化是主要过程。在Qi等(2004)的试验研究中也证实了在垃圾堆肥时，用微生物菌群降解腐植酸，优先矿化的是烷基碳。

图6 培养前后从Guanella泥炭(a)、Poinsett土壤(b)、Pahokee泥炭(c)、风化褐煤(d)中分离出的自组装样品(HA0，L0)、物理混合物(HA0/3，L0/2)及组分(HA1，HA2，L1)的碳类型分布

3 讨论

3.1 自组装对有机质样品微生物降解的影响

先前的研究认为，非化学特性因素对SOM的稳定性产生重大影响。MacCarthy和Rice(1991)认为，SOM的异质性是其长久存在于环境中的主要原因，且提出其分子的不规则性使微生物处于混乱的分子环境中，这种混乱可能抢占SOM作为模板引导生物后代快速利用其作为能源或营养来源而进化；Almendr os和Dor ado(2009)也认为SOM具有复杂性，提出其难以降解的原因在于材料的无序结构和重复单元的缺失；Puglisi等(2009)也指出了SOM结构的复杂性，并认为能够解释SOM稳定的原因是其联合的强度而不是特定分子组成的差异；Pap a等(2010)将SOM的稳定性归因于其纳米结构，且提出降解性与微孔率相关。以上研究结果分析的SOM样品化学组成不同，因此，他们的分析结果不能从其他影响因素中分离出化学成分的影响。

然而在本研究中，我们能够从仅在组织程度上存在差异的样品中，通过直接的数据比较，分离出对矿化产生影响的组织。

通过每种材料中L0和HA0与其相应的物理混合物(分别为L0/2和H A0/3)的矿化比较研究，发现自组装增强矿化。自组装样品的矿化程度与其相应物理混合物相比，高达70%。矿化增强趋势与自组装程度取决于热容量变化的趋势一致(图8)。热容量变化越大，样品的自组装程度越高，其比相应物理混合物的矿化程度越高。

有机质的组织程度不但影响碳的矿化量，也对微生物有机体消耗碳的类型有一定影响。对如Poinsett土壤和Pahokee泥炭中的L0等原始自组装样品而言，所有类型的碳均发生了矿化，而其相应的物理混合物中仅发生了脂肪族和烷基碳的矿化，因此，我们可以假设，自组装越多，发生的碳优先矿化越少。究其原因在于，微观世界中微生物1次只能利用1个纳米结构。然而，由于没有短期矿化的数据，不能排除动力学效应，即可能是由于碳矿化初期主要消耗脂肪族和氧烷基碳，而后期主要利用芳香族和羧基碳。

图8 在不同自组装程度(ΔC p = C p自组装-C p混合物，C p表示热容量)下自组装样品(HA0，L0)的矿化变化率(百分比变动)Fig.8 Variation of mineralization (percentage change) with the extent of self-assembly (ΔC p = C pself-assembled-C p mixture,where C p is the heat capacity) for the self-assembled samples (HA 0, L 0)

3.2 化学成分对有机质样品微生物降解的影响

本研究主要通过比较结构组成未受到影响的样品，例如物理混合物L0/2和H A0/3，以及HA1、HA2和L1组分，来研究化学成分对微生物降解有机质样品的影响。通过分析13C核磁共振测得的相关参数如碳类型含量和有机质疏水性指数得到样品的生物降解相关性。

微生物降解程度与芳香碳相关性最好(图9)，R2值为0.498。研究结果表明，芳香族化合物从占总有机碳的60%降至10%，而矿化量则增加了70%。其他碳类型或疏水性指数均与矿化程度不相关。

自组装样品之间的比较结果表明，13C核磁共振测得参数间不存在相关性，且不随样品芳香性而变(图9)。这表明，化学成分对自组装样品矿化的影响有限，但对非自组装或自组装程度有限的样品起影响作用，这可能填补了化学成分影响碳稳定性研究的空缺。对高度自组装系统而言，化学成分可能并非是影响SOM微生物降解的直接原因，然而，却不能排除化学成分对各组分自组装的间接作用，以上推测有待进一步研究。

图9 非自装组腐植酸样品(物理混合物L0/2和HA0/3，以及组分HA1，HA2和 L1)矿化随芳香碳含量的变化Fig.9 Variation of mineralization with aromatic carbon content for humic acid samples without organization (mixtures L 0/2, HA 0/3, and fractions HA 1, HA 2, and L 1)-fi lled symbolsand for self-assembled samples (L 0)

3.3 碳稳定性的意义

本研究结果表明，与化学成分相比，SOM自组装程度对其矿化作用影响更大，但化学成分对SOM矿化的影响研究尚欠缺。由于土壤和SOM的化学复杂性及外界环境如有机质投入、p H、湿度、温度和微生物活性等变化，SOM自组装更可能是一个动态的过程。因此，自组织程度变化比SOM的化学成分变化更容易在短时间内发生。

有报道表明，腐植酸对不同微生物种群的抗降解能力不同。本研究中仅使用了单一的接种体，还需考虑不同种类微生物的作用以及不同来源材料样品矿化作用的比较。

假设腐植酸原始样品与其相应物理混合物仅为自组装程度不同，假定温和的提取步骤未引起各成分中化学性质的改变，致使氢键键合能力和疏水性相互作用较弱。原始样品和物理混合物样品核磁共振光谱分析结果类似，提取过程中碳的回收率高，证实了以上假设的正确性。然而，因SOM具有宽泛的核磁共振峰，本试验中不排除未被检出的小变化。虽然本研究中使用的方法是成功的，最大限度地减少了这些潜在影响，但是扩大这些结论的适用性是一个很有前景的研究领域。

致谢和参考文献(略)